基因编辑技术含有参考文献论文

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环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。 随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。 根据circRNA序列的来源，可以分为3类： 1. 序列全部来源于外显子，称为Exonic circRNAs   2.  序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs   3. 序列全部来源于内含子，称为ciRNAs。 circRNA是由mRNA前体（pre-mRNA）经反向剪接（back-splicing）形成的，目前报道的成环模型主要有以下3种： · 内含子反向互补序列驱动环化环化 外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，反向互补序列促使内含子序列配对，使得下游的剪接供体（Splice-Donor）与上游的剪接受体（Splice-Acceptor）靠近，从而结合形成环状RNA。（图1.左） · RNA结合蛋白驱动环化 环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白（RBPs）识别的基序，RBP分别与两翼内含子特异基序结合后，会形成二聚体，促进两翼内含子互相靠近，进而连接成环。（图1.右） · 套索驱动环化 mRNA前体剪接时，会发生外显子跳读事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，随后该中间体发生反向剪接，形成环状RNA。（图2.） circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子： Cdr1as，它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点，其中与miR-7的结合方式是非完全互补，只是结合，不会被AGO2蛋白介导降解，而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，无法抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌症的发生。当miR-671高表达时，Cdr1as被降解，miRNA得到释放，与原癌基因mRNA结合，起到基因下调的作用，抑制癌症的发生。（图3.） 很多环状RNA上含有蛋白结合的位点，可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL，可结合亲本基因第二外显子，促使其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl又能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少MBL生成。 除了作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。 （参考文献：Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.） 随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌，食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。 除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，检测及治疗方面也可以起到重要的作用。 circRNA敲除方案比较难设计，一般会使用以下两种方法： 方案一：将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端，直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，需要根据具体的实验目的考虑是否可行。   方案二：通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件，成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后，在两端设计gRNA进行敲除，既不破坏编码基因的外显子，又可以实现circRNA的敲除（图4.） 应用案例： circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） 在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。 源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。 应用案例： 用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。 利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA 载体表达 系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。（图9.）

crispr基因编辑技术

基因编辑革命先驱者詹妮弗·杜德纳讲述CRISPR技术的发现历史，作用机理个应用前景

CRISPR技术是一种简单而强大的基因组编辑工具。它使研究人员能够很容易地改变DNA序列和修改基因功能。它的许多潜在应用包括纠正遗传缺陷、治疗和防止疾病传播以及改良作物。然而，它的承诺也引起了伦理问题。

在流行用法中，“CRISPR”（发音为“crisper”）是“CRISPR-Cas9”的缩写。CRISPRs是DNA的特殊延伸。蛋白质Cas9（或“CRISPR相关”）是一种类似于一对分子剪刀的酶，能够切割DNA链。

CRISPR技术是根据细菌和古细菌（单细胞微生物领域）的自然防御机制改编而成的。这些生物体利用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白（包括Cas9）来抵御病毒和其他异物的攻击。他们这样做主要是通过切割和破坏外国侵略者的DNA。当这些成分被转移到其他更复杂的有机体中时，它允许对基因进行操作或“编辑”。

直到2017年，没有人真正知道这个过程是什么样子的。在2017年11月10日发表在《自然通讯》杂志上的一篇论文中，由金泽大学的Shibata Mikihiro和东京大学的Hiroshi Nishimasu领导的一个研究小组展示了CRISPR第一次运行时的样子。[一个惊人的新GIF显示CRISPR咀嚼DNA]

CRISPRs：“CRISPR”代表“有规律间隔的短回文重复序列簇”。它是DNA的一个特殊区域，具有两个明显的特征：核苷酸重复序列和间隔序列的存在。核苷酸的重复序列——DNA的组成部分——分布在CRISPR区域。间隔序列是散布在这些重复序列中的DNA片段。

对于细菌来说，间隔序列是从先前攻击有机体的病毒中提取的。它们作为一个记忆库，使细菌能够识别病毒并抵御未来的攻击。

这是由食品配料公司Danisco的Rodolphe Barrangou和一组研究人员首次通过实验证明的。在2007年发表在《科学》杂志上的一篇论文中，研究人员以酸奶和其他乳制品培养物中常见的嗜热链球菌为模型。他们观察到，病毒攻击后，新的间隔蛋白被整合到CRISPR区域。此外，这些间隔区的DNA序列与病毒基因组的部分序列相同。他们还通过取出或放入新的病毒DNA序列来操纵间隔区。通过这种方式，他们能够改变细菌对特定病毒攻击的抵抗力。因此，研究人员证实了CRISPR在调节细菌免疫中的作用。

CRISPR RNA（crRNA）：一旦一个间隔基被结合并且病毒再次攻击，CRISPR的一部分被转录并加工成crisprrna或“crRNA”。CRISPR的核苷酸序列作为模板产生互补的单链RNA序列。根据Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2014年发表在《科学》杂志上的一篇评论，每个crRNA由一个核苷酸重复序列和一个间隔部分组成。

Cas9：Cas9蛋白是一种切割外来DNA的酶。

该蛋白通常与两个RNA分子结合：crRNA和另一个称为tracrRNA（或“反式激活crRNA”）。两人随后将Cas9引导至目标地点，在那里进行切割。这片DNA是对crRNA的20个核苷酸延伸的补充。

使用两个独立的区域，或其结构上的“域”，Cas9切割DNA双螺旋的两条链，使所谓的“双链断裂”，根据2014年的科学文章。

有一个内置的安全机制，它确保Cas9不会在基因组中的任何地方被切断。已知短DNA序列s-PAMs（“邻近原间隔基序”）作为标记，与目标DNA序列相邻。如果Cas9复合物的目标DNA序列旁边没有PAM，它就不会被切割。根据《自然生物技术》（Nature Biotechnology）2014年发表的一篇评论，这可能是Cas9从未攻击细菌CRISPR区的一个原因。

不同生物体的基因组在其DNA序列中编码一系列信息和指令。基因组编辑包括改变这些序列，从而改变信息。这可以通过在DNA中插入一个切口或一个断裂，并诱细胞的自然DNA修复机制来引入人们想要的改变来实现。CRISPR-Cas9提供了一种方法。

在2012年，两篇关键的研究论文发表在《科学》和《国家科学院学报》上，这两篇论文帮助细菌CRISPR-Cas9转化为一个简单的、可编程的基因组编辑工具。

这项研究由不同的小组进行，结论：Cas9可以直接切割DNA的任何区域。这可以通过简单地改变crRNA的核苷酸序列来实现，crRNA与互补的DNA靶点结合。在2012年的《科学》文章中，Martin Jinek和他的同事们进一步简化了这个系统，将crRNA和tracrRNA融合在一起形成一个单一的“导向RNA”。因此，基因组编辑只需要两个组成部分：导向RNA和Cas9蛋白。

，哈佛医学院遗传学教授乔治·丘奇说：“你设计了一段20个核苷酸碱基对，它们与你想要编辑的基因相匹配。”。构建了与这20对碱基互补的RNA分子。丘奇强调了确保核苷酸序列只在目标基因中发现，而在基因组中没有其他发现的重要性。”然后，RNA加上蛋白质[Cas9]会像剪刀一样在那个位置切割DNA，理想情况下是在别的地方，“他解释道，”一旦DNA被切割，细胞的自然修复机制就会启动，并将突变或其他变化引入基因组。这有两种可能发生的方式。根据斯坦福大学的亨廷顿外展项目，一种修复方法是将两个切口粘在一起。这种被称为“非同源末端连接”的方法容易引入错误。核苷酸意外插入或删除，导致突变，从而破坏基因。在第二种方法中，通过用核苷酸序列填充间隙来固定断裂。为了做到这一点，细胞使用短链DNA作为模板。科学家可以提供他们选择的DNA模板，从而写入他们想要的任何基因，或纠正突变。

CRISPR-Cas9近年来变得流行起来。Church指出，这项技术易于使用，其效率大约是之前最好的基因组编辑工具（称为TALENS）的四倍，美国麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的丘奇和张峰实验室的研究人员首次发表了在实验环境中使用CRISPR-Cas9编辑人体细胞的报告。利用人类疾病的体外（实验室）和动物模型进行的研究表明，该技术可以有效地纠正遗传缺陷。根据《自然生物技术》杂志2016年发表的一篇评论文章，此类疾病的例子包括囊性纤维化、白内障和范科尼贫血。这些研究为人类的治疗应用铺平了道路。

“我认为公众对CRISPR的认识非常集中于临床上使用基因编辑治疗疾病的想法，”纽约基因组中心的内维尔·桑贾纳和纽约大学生物、神经科学和生理学助理教授说这无疑是一个令人兴奋的可能性，但这只是一小部分。

CRISPR技术也被应用于食品和农业工业，以设计益生菌培养物和疫苗食用工业培养物（例如酸奶）以防病毒。它还被用于提高作物的产量、耐旱性和营养特性。

另一个潜在的应用是创造基因驱动。这些是遗传系统，它增加了一个特殊的性状从父母传给后代的机会。最终，根据Wyss研究所的研究，这种特性会在几代人中传播到整个群体。根据2016年《自然生物技术》的文章，基因驱动可以通过增强疾病载体（雌性冈比亚按蚊）的不育性来帮助控制疟疾等疾病的传播。此外，根据Kenh Oye及其同事在2014年发表在《科学》杂志上的一篇文章，基因驱动也可用于根除入侵物种，逆转对杀虫剂和除草剂的抗性，Church告诉Live Science：“CRISPR-Cas9并非没有缺点，

“我认为CRISPR最大的局限是它没有百分之百的效率。”。此外，基因组编辑效率可能会有所不同。根据Doudna和Charpentier在2014年发表的一篇科学文章，在一项在水稻上进行的研究中，接受Cas9 RNA复合物的细胞中，近50%发生了基因编辑。然而，其他的分析表明，根据目标，编辑效率可以达到80%或更高。

也有“目标外效应”的现象，即DNA在目标以外的位置被切割。这可能导致意外突变的引入。此外，丘奇还指出，即使系统按目标进行了削减，也有可能得不到精确的编辑。他称之为“基因组破坏”。

CRISPR技术的许多潜在应用提出了关于篡改基因组的伦理价值和后果的问题。

在2014年的科学文章中，Oye和同事们指出了使用基因驱动器的潜在生态影响。一个引进的性状可以通过杂交从目标群体传播到其他有机体。基因驱动也会降低目标群体的遗传多样性。

对人类胚胎和生殖细胞（如 *** 和卵子）进行基因修饰被称为生殖系编辑。由于这些细胞的变化可以遗传给下一代，使用CRISPR技术进行生殖系编辑已经引起了许多伦理问题。

的可变功效、偏离目标的效果和不精确的编辑都会带来安全风险。此外，还有许多科学界尚不清楚的问题。在2015年发表在《科学》杂志上的一篇文章中，大卫巴尔的摩和一组科学家、伦理学家和法律专家指出，生殖系编辑增加了对后代产生意外后果的可能性，“因为我们对人类遗传学、基因与环境相互作用的知识有限，以及疾病的途径（包括一种疾病与同一病人的其他情况或疾病之间的相互作用）。

其他伦理问题更为微妙。我们是否应该在未经后代同意的情况下，做出可能从根本上影响后代的改变？如果使用生殖系编辑从一种治疗工具转变为一种增强工具，以适应各种人类特征，会怎么样？

为了解决这些问题，国家科学、工程和医学院编写了一份全面的报告，其中包括基因组编辑的指导方针和建议。

尽管国家科学院敦促谨慎从事生殖系编辑，他们强调“谨慎并不意味着禁止”，他们建议只在导致严重疾病的基因上进行生殖系编辑，并且只有在没有其他合理的治疗方法的情况下才进行。在其他标准中，他们强调需要有关于健康风险和益处的数据，以及在临床试验期间需要持续监督。他们也推荐

最近有许多基于CRISPR的研究项目生物化学家和CRISPR专家萨姆·斯特恩伯格（Sam Sternberg）说：“由于CRISPR，基础研究发现的速度已经爆炸了。”他是加利福尼亚州伯克利市Caribou Biosciences Inc.的技术开发小组负责人，该公司正在开发基于CRISPR的医药、农业解决方案，以及生物研究。

这里是一些最新的发现：

“Live Science contributor Alina Bradford的附加报告”

附加资源

基因编辑有关参考文献

β细胞是人体的胰岛素“工厂”。它们对升高的血糖作出反应，分泌出胰岛素，向肌肉细胞发出信号，以吸收并利用血液中的葡萄糖。

糖尿病患者的β细胞往往不能产生足够的胰岛素：对于2型糖尿病患者而言，是由于β细胞随着时间的推移而功能下降。对于1型糖尿病患者而言，是由于自身免疫系统发生故障，并攻击、损坏了β细胞。

在一些糖尿病患者中，β细胞衰竭是基因缺陷所导致的结果。在过去的十年里，研究人员发现基因代码中的少数几个地方，一旦发生微小的错误就会干扰身体感应或产生胰岛素的能力。其结果就是医学上所说的“单基因糖尿病”。

这种单基因突变导致的糖尿病远比人们所知的要多。美国纽约哥伦比亚大学Naomi Berrie糖尿病中心的干细胞生物学家Dieter Egli博士指出，大约1%到5%的糖尿病患者属于单基因糖尿病，在全球范围内这个数字以百万计，因此“单基因糖尿病”并不是一种罕见的疾病。

几十年来，替换失去功能的β细胞一直是治疗所有类型糖尿病的“圣杯”（注：代指具有神奇能力的事物）。研究人员已经尝试了从移植胰腺到植入β细胞的多种方法，但是，这些手术的成本很高，因为它们是外来器官、细胞，身体会排斥它们，控制这种免疫排斥反应需要借助强大的免疫抑制药物，或是用某种方法将所移植的β细胞“封装”起来，以瞒过自身免疫系统。

由于单基因糖尿病是单一基因缺陷或突变的结果，新的基因技术为单基因糖尿病患者提供了治愈的希望，甚至一些2型糖尿病患者也有望获得治愈。在美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）的资助下，Dieter Egli博士和他的科研团队正在进行单基因糖尿病的研究，特别是对于一些出生时或出生不久后身体就不能产生胰岛素的病例，他们制造出干细胞，借由干细胞再制造某些特定的人体组织，包括β细胞、神经组织等。

然后，他们使用了一种名为“CRISPR-Cas9”的尖端技术，来修复那些阻止β细胞正常工作的基因错误 [1] 。在过去的一年里，这项研究取得了可喜的成果，他们已经能够纠正干细胞的突变，使β细胞重新产生胰岛素。

下一步预期，可将经过修正的 β细胞 重新植入患者体内。因为它们来源于患者自身的细胞，所以可以被身体接受而不需要应用免疫抑制药物，植入后预计能像正常β细胞那样对血糖水平做出反应，并且产生胰岛素。

然而，基因编辑所依托的科学技术太前沿了，以至于还没有被美国食药监局（FDA）批准用于人体试验。为了观察新的β细胞是否能起作用，Dieter Egli博士将修正后的人类β细胞植入β细胞受损的实验动物体内。人们欣喜地看到，通过将β细胞移植到小鼠体内，可以保护缺乏 β细胞 的小鼠免于罹患糖尿病。

Dieter Egli博士说，如果能将修正后的β细胞安全地植入患有单基因糖尿病的人体内，那就相当于治愈了糖尿病。

在基因编辑技术应用于人类之前，还有很多工作要做。一些研究者担心，用于编辑基因突变的技术可能会在其他地方引起意想不到的“偏离目标”的影响。Egli博士表示，“利用老鼠模型是一个很好的开始，但是只有在人类身上进行尝试，我们才能最终得到答案。”

即使Egli博士和其他领域的研究人员能够证明这种基因治疗是安全的，与试纸、血糖仪和胰岛素注射相比，要获得好的成本-效益比，可能还需要一些时间。虽然到那时，患者不再需要支付胰岛素、口服降糖药和其他血糖管理用品的费用，但预计个性化干细胞治疗也可能会花费每位患者数万美元，甚至更多。

据了解，目前在国内也有一些学者在进行相关研究 [2] 。因此，笔者愿意乐观地相信，随着研究的深入、技术的成熟和普及，这种可能会治愈糖尿病的新疗法将会有走出实验室、走近你我身边的那一天。让我们一同拭目以待，继续关注来自这一领域的好消息吧！

参考文献：

[1] Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice[J]. Exp Anim, 2016，65(3):319-327.

[2] 曹曦，宋丽妮，张怡尘，等. 应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型[J]. 首都医科大学学报，2018，39（4）：517-521.

DOI:

microhomology-mediated end-joining (MMEJ)

DNA double-strand break (DSB)

local accumulation of DSB repair molecules (LoAD) system

homologous recombination (HR)

non-homologous end-joining (NHEJ)

homology-independent targeted integration (HITI) system

precise integration into target chromosome (PITCh) system

single-strand template repair (SSTR)

Gaps: 以往的研究从未在多个基因组位点同时产生多种模式或多个报告基因的组合。基因插入在每个位点独立进行，在不同的基因位点上进行双或三重敲入需要一定的步骤。

横向比较： CRISPR-Cas9基因标记使用的方法有（1）同源修复HR，（2）非同源end-joining NHEJ，（3）微同源介导的end-joining MMEJ。虽然HR的方法可以非常精准的knockin，但它的载体的构建和效率远低于end-joining的方法。

工作简介 ：

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原因在于：MS2可以与RNA结合，从而报告RNA的情况，将MS2与CtIP融合，可将CtIP导向到sgRNA所在的位置，形成一个滞留，发挥CtIP增加MMEJ的功效，从而造成了更多的DNA断裂，插入效率增加。

之前我看过一篇文章，说的是CRISPR-Cas9的效果由于P53的存在而大打折扣，而P53对抗HDR是CRISPR-Cas9造成DSB无法被修复，从而介导了CRISPR-Cas9的细胞毒性。那么就会有以下两种情况：（1）P53存在时，CRISPR-Cas9效果不好，且有细胞毒性；（2）P53敲除时，CRISPR-Cas9效率增加，但有致癌的风险。以此引发临床安全性的思考，提醒在人体上使用CRISPR-Cas9治疗需要注意的安全性问题，从而以一个相对简单的故事，发表在了Nature Medicine上。所以，我们在使用基因编辑工具的时候，需要注意一下它的细胞毒性情况。

老板亲自传授的文献阅读方法

（1）FACS结果显示，没有毒性：首先转入已被证实具有细胞毒性的载体来作为对照，MS2-CtIP组没有对细胞增殖产生影响，而ZFN组有。

（2）如我前面所说，DSB如无法被修复，则是细胞毒性。在这里作者也使用DSB修复实验来代表细胞毒性实验，首先使用依托泊苷诱导DSB，然后使用anti-γ-H2AX染色来查看修复情况，发现MS2-CtIP组DSB修复活性显著高于对照组。

以上结果表明，MS2-CtIP是通过诱导DSB修复来达到低（无）细胞毒性的效果。

我就不写了。。。因为我没看明白，嘤嘤嘤。

第一部分主要讲基因编辑系统的构建及基本情况，接下来就要讲一讲它作为一个基因编辑工具的基本素养了。

太多啦！简单说一下，就是对比了MMEJ和NHEJ它们在精确敲入，非精确敲入和未敲入这三个方面的情况，得到MMEJ几乎完败NHEJ的结论咯。 看看这图画得多漂亮！

回归前面说的Gaps，同时对多个基因进行编辑呢？结果显示是可以高效、准确的对多个基因进行编辑。这部分是灰常灰常棒的。

学习一下人家的思路~

创新点在于MS2的定位效应，MS2-CtIP的增强效应，MMEJ的精巧性。

参考文献： Nakade S, Mochida K, Kunii A, et al. Biased genome editing using the local accumulation of DSB repair molecules system[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 3270.

基因编辑技术研究进展参考文献

β细胞是人体的胰岛素“工厂”。它们对升高的血糖作出反应，分泌出胰岛素，向肌肉细胞发出信号，以吸收并利用血液中的葡萄糖。

糖尿病患者的β细胞往往不能产生足够的胰岛素：对于2型糖尿病患者而言，是由于β细胞随着时间的推移而功能下降。对于1型糖尿病患者而言，是由于自身免疫系统发生故障，并攻击、损坏了β细胞。

在一些糖尿病患者中，β细胞衰竭是基因缺陷所导致的结果。在过去的十年里，研究人员发现基因代码中的少数几个地方，一旦发生微小的错误就会干扰身体感应或产生胰岛素的能力。其结果就是医学上所说的“单基因糖尿病”。

这种单基因突变导致的糖尿病远比人们所知的要多。美国纽约哥伦比亚大学Naomi Berrie糖尿病中心的干细胞生物学家Dieter Egli博士指出，大约1%到5%的糖尿病患者属于单基因糖尿病，在全球范围内这个数字以百万计，因此“单基因糖尿病”并不是一种罕见的疾病。

几十年来，替换失去功能的β细胞一直是治疗所有类型糖尿病的“圣杯”（注：代指具有神奇能力的事物）。研究人员已经尝试了从移植胰腺到植入β细胞的多种方法，但是，这些手术的成本很高，因为它们是外来器官、细胞，身体会排斥它们，控制这种免疫排斥反应需要借助强大的免疫抑制药物，或是用某种方法将所移植的β细胞“封装”起来，以瞒过自身免疫系统。

由于单基因糖尿病是单一基因缺陷或突变的结果，新的基因技术为单基因糖尿病患者提供了治愈的希望，甚至一些2型糖尿病患者也有望获得治愈。在美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）的资助下，Dieter Egli博士和他的科研团队正在进行单基因糖尿病的研究，特别是对于一些出生时或出生不久后身体就不能产生胰岛素的病例，他们制造出干细胞，借由干细胞再制造某些特定的人体组织，包括β细胞、神经组织等。

然后，他们使用了一种名为“CRISPR-Cas9”的尖端技术，来修复那些阻止β细胞正常工作的基因错误 [1] 。在过去的一年里，这项研究取得了可喜的成果，他们已经能够纠正干细胞的突变，使β细胞重新产生胰岛素。

下一步预期，可将经过修正的 β细胞 重新植入患者体内。因为它们来源于患者自身的细胞，所以可以被身体接受而不需要应用免疫抑制药物，植入后预计能像正常β细胞那样对血糖水平做出反应，并且产生胰岛素。

然而，基因编辑所依托的科学技术太前沿了，以至于还没有被美国食药监局（FDA）批准用于人体试验。为了观察新的β细胞是否能起作用，Dieter Egli博士将修正后的人类β细胞植入β细胞受损的实验动物体内。人们欣喜地看到，通过将β细胞移植到小鼠体内，可以保护缺乏 β细胞 的小鼠免于罹患糖尿病。

Dieter Egli博士说，如果能将修正后的β细胞安全地植入患有单基因糖尿病的人体内，那就相当于治愈了糖尿病。

在基因编辑技术应用于人类之前，还有很多工作要做。一些研究者担心，用于编辑基因突变的技术可能会在其他地方引起意想不到的“偏离目标”的影响。Egli博士表示，“利用老鼠模型是一个很好的开始，但是只有在人类身上进行尝试，我们才能最终得到答案。”

即使Egli博士和其他领域的研究人员能够证明这种基因治疗是安全的，与试纸、血糖仪和胰岛素注射相比，要获得好的成本-效益比，可能还需要一些时间。虽然到那时，患者不再需要支付胰岛素、口服降糖药和其他血糖管理用品的费用，但预计个性化干细胞治疗也可能会花费每位患者数万美元，甚至更多。

据了解，目前在国内也有一些学者在进行相关研究 [2] 。因此，笔者愿意乐观地相信，随着研究的深入、技术的成熟和普及，这种可能会治愈糖尿病的新疗法将会有走出实验室、走近你我身边的那一天。让我们一同拭目以待，继续关注来自这一领域的好消息吧！

参考文献：

[1] Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice[J]. Exp Anim, 2016，65(3):319-327.

[2] 曹曦，宋丽妮，张怡尘，等. 应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型[J]. 首都医科大学学报，2018，39（4）：517-521.

［3］ 赵艳,于彦春,钱前,等.无载体主干序列的bar和cecropin B基因表达框共转化水稻［J］. 遗传学报,2003,30（2）:135-141. ［4］ 安韩冰,朱祯,李慧芬,等.基因枪法转化水稻（Oryza sativa L.）获得可育的转抗虫基因水稻再生植株［J］. 高技术通讯,2001,2:12-17. ［5］ CHU Qi-ren, CAO Hua-xin, FAN Hui-qin, et al.. Preliminary report on transienexpression of gus gene in transgene rice protoplast-derived calli via PEG-mediated DNA transformation［J］. shanghai nongye xue bao,1995,11(3):63-68. ［6］ 赵凌,王才林,宗寿余,等. 花粉管介导的转bar基因水稻植株的获得及其遗传［J］. 中国生物工程杂志,2003,23（8）:92-95. ［7］ LI L C, QU R D, KOCHKO A,et al.. An improved transformation of embryogenic grape cell suspensions［J］. Plant Cell Report,1993,12:250-255. ［8］ 范钦,许新萍,黄小乐,等. 早籼稻培矮64S愈伤组织形成及植株再生［J］. 西北植物学报,2002,22（6）:1 469-1 473. ［9］ 易自力,曹守云,王力,等. 提高农杆菌转化水稻频率的研究［J］. 遗传学报,2001,28（4）:352-358. ［10］ 郑宏红,何锶洁,戴顺洪,等. 提高水稻基因枪转化效率的研究［J］. 生物工程学报,1996,（增）:111-115. ［11］ 田文忠,IAN RANCE,ELUNIALAI,等. 提高籼稻愈伤组织再生频率的研究［J］. 遗传学报,1994,21（3）:215-221. ［12］ 叶松青,储成才,曹守云,等. 提高水稻转化率几个因素的研究［J］. 遗传学报,2001,28（10）:933-938. ［13］ 刁现民,陈振玲,段胜军,等. 影响谷子愈伤组织基因枪转化的因素［J］. 华北农学报,1999,14（3）:31-36. ［14］ 易自力,王力,曹守云,等. 提高籼稻基因枪转化频率的研究［J］. 高技术通讯,2000,10(11):12-15. ［15］ 薛锐,曹守云,杨炜,等. 基因枪法转化籼稻有关因素的评价［J］. 中国水稻科学,1998,12（1）:21-26. ［16］ LI L C, TIAN W Z, YANG M, et al.. Establishment of an efficient transformation system for rice(Oryza Sativa L.) ［A］.农业的未来-转基因技术研究［C］. 长沙,湖南科学技术出版社,2002. ［17］ 马炳田,朱祯,李平,等. 水稻遗传转化选择系统优化初探［J］. 西南农业学报,2003,16（1）:28-31. ［18］ 唐祚舜,王象坤,李良才,等. 基因枪法转基因水稻中HPT基因稳定遗传［J］. 遗传学报,2000,27（1）:26-33. ［19］ 陶利珍,凌定厚,张世平,等. 基因枪介导的籼稻遗传转化及外源基因在受体中的遗传研究［J］. 武汉植物学研究,1999,17（4）:289-296. ［20］ CHENG Zai-quan,HUANG Xing-qi,RAY Wu,et al..Comparison of biolistic and agrobacterium-mediated transformation methods on transgene copy number and rearrangement frequency in rice［J］. Acta Botanica Sinica, 2001,43(8):826-833.

基因编辑的参考文献

β细胞是人体的胰岛素“工厂”。它们对升高的血糖作出反应，分泌出胰岛素，向肌肉细胞发出信号，以吸收并利用血液中的葡萄糖。

糖尿病患者的β细胞往往不能产生足够的胰岛素：对于2型糖尿病患者而言，是由于β细胞随着时间的推移而功能下降。对于1型糖尿病患者而言，是由于自身免疫系统发生故障，并攻击、损坏了β细胞。

在一些糖尿病患者中，β细胞衰竭是基因缺陷所导致的结果。在过去的十年里，研究人员发现基因代码中的少数几个地方，一旦发生微小的错误就会干扰身体感应或产生胰岛素的能力。其结果就是医学上所说的“单基因糖尿病”。

这种单基因突变导致的糖尿病远比人们所知的要多。美国纽约哥伦比亚大学Naomi Berrie糖尿病中心的干细胞生物学家Dieter Egli博士指出，大约1%到5%的糖尿病患者属于单基因糖尿病，在全球范围内这个数字以百万计，因此“单基因糖尿病”并不是一种罕见的疾病。

几十年来，替换失去功能的β细胞一直是治疗所有类型糖尿病的“圣杯”（注：代指具有神奇能力的事物）。研究人员已经尝试了从移植胰腺到植入β细胞的多种方法，但是，这些手术的成本很高，因为它们是外来器官、细胞，身体会排斥它们，控制这种免疫排斥反应需要借助强大的免疫抑制药物，或是用某种方法将所移植的β细胞“封装”起来，以瞒过自身免疫系统。

由于单基因糖尿病是单一基因缺陷或突变的结果，新的基因技术为单基因糖尿病患者提供了治愈的希望，甚至一些2型糖尿病患者也有望获得治愈。在美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA）的资助下，Dieter Egli博士和他的科研团队正在进行单基因糖尿病的研究，特别是对于一些出生时或出生不久后身体就不能产生胰岛素的病例，他们制造出干细胞，借由干细胞再制造某些特定的人体组织，包括β细胞、神经组织等。

然后，他们使用了一种名为“CRISPR-Cas9”的尖端技术，来修复那些阻止β细胞正常工作的基因错误 [1] 。在过去的一年里，这项研究取得了可喜的成果，他们已经能够纠正干细胞的突变，使β细胞重新产生胰岛素。

下一步预期，可将经过修正的 β细胞 重新植入患者体内。因为它们来源于患者自身的细胞，所以可以被身体接受而不需要应用免疫抑制药物，植入后预计能像正常β细胞那样对血糖水平做出反应，并且产生胰岛素。

然而，基因编辑所依托的科学技术太前沿了，以至于还没有被美国食药监局（FDA）批准用于人体试验。为了观察新的β细胞是否能起作用，Dieter Egli博士将修正后的人类β细胞植入β细胞受损的实验动物体内。人们欣喜地看到，通过将β细胞移植到小鼠体内，可以保护缺乏 β细胞 的小鼠免于罹患糖尿病。

Dieter Egli博士说，如果能将修正后的β细胞安全地植入患有单基因糖尿病的人体内，那就相当于治愈了糖尿病。

在基因编辑技术应用于人类之前，还有很多工作要做。一些研究者担心，用于编辑基因突变的技术可能会在其他地方引起意想不到的“偏离目标”的影响。Egli博士表示，“利用老鼠模型是一个很好的开始，但是只有在人类身上进行尝试，我们才能最终得到答案。”

即使Egli博士和其他领域的研究人员能够证明这种基因治疗是安全的，与试纸、血糖仪和胰岛素注射相比，要获得好的成本-效益比，可能还需要一些时间。虽然到那时，患者不再需要支付胰岛素、口服降糖药和其他血糖管理用品的费用，但预计个性化干细胞治疗也可能会花费每位患者数万美元，甚至更多。

据了解，目前在国内也有一些学者在进行相关研究 [2] 。因此，笔者愿意乐观地相信，随着研究的深入、技术的成熟和普及，这种可能会治愈糖尿病的新疗法将会有走出实验室、走近你我身边的那一天。让我们一同拭目以待，继续关注来自这一领域的好消息吧！

参考文献：

[1] Hasegawa Y, Hoshino Y, Ibrahim AE, et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in Ins1-cre driver mice[J]. Exp Anim, 2016，65(3):319-327.

[2] 曹曦，宋丽妮，张怡尘，等. 应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型[J]. 首都医科大学学报，2018，39（4）：517-521.

自 20 世纪 70 年代末开始，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势。美国女性乳腺癌的患病率高达。中国虽然不是乳腺癌的高发国家，但是近年来我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家 1～2 个百分点。同时，在卫计委公布的 2013 年年鉴中显示，我国在2004年到2005年间，乳腺癌的已经成为女性死亡率最高的生殖系统肿瘤。甚至有研究表明，现在在中国，与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症。 多梳基因家族（polycomb group，PcG）蛋白PcG是一类表观遗传抑制因子，包括PRC1和PRC2两大复合物，在决定细胞命运以及肿瘤发生等方面发挥重要作用。PCGF1是多梳基因家族PRC1复合体的重要组成部分，该复合体主要包括PCGF蛋白、CBX蛋白，RING1蛋白和HPH蛋白。 前期研究发现PCGF1在多种肿瘤细胞中表达丰度较高，尤其以乳腺癌细胞和胶质瘤细胞表达尤为明显。以PCGF1序列为模板，设计sgRNA干扰序列，两端加入载体连接序列。通过DNA片段合成所需sgRNA序列。退火形成oligo二聚体序列后，使用T4 DNA连接酶重组干扰序列与pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒，最终成功构建 PCGF1 敲低载体。将pCAG-T7-Cas9-gRNA-pgk-Puro-T2AGFP重组载体通过脂质体转染MCF7细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，Western blotting检测PCGF1表达。结果显示成功得到了PCGF1稳定敲低的MCF7细胞系转染 MCF7 细胞系。 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒.测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG,PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞.采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序,Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞.结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞.免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布.结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础. ESR1突变已经被证实与乳腺癌内分泌治疗耐药密切相关，在经过至少一线内分泌治疗的转移性乳腺癌患者中，ESR1 LBD突变的阳性率在54%左右，研究证实Y537S位点突变型ER的活性最高，并且近几年的研究发现ESR1 Y537S突变不仅对传统的内分泌治疗耐药，也会对最新的CDK4/6抑制剂产生耐药。 为了解决晚期转移性患者在化疗期间遇到的一系列问题，空军军医大学西京医院李南林教授与来自哈佛大学Dana-Farber Cancer Institute 的乳腺癌专家Rinath Jeselsohn开展合作，最终发现氟维司群联合化疗在ER阳性、P53野生型乳腺癌细胞系中具有协同效应，同时拥有ESR1 Y537S突变的细胞系具有更高的协同效应分数；细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡增加可能是这两种药物发挥协同作用的主要机制。因此，对于ESR1 Y537S突变、P53野生型的乳腺癌患者，氟维司群联合化疗或许可以发挥更好的作用，但仍需进一步动物实验和临床试验研究证实。 参考文献： 闫睿, 樊嵘, 董瓅瑾,等. 利用CRISPR/Cas9系统构建PCGF1基因敲除MCF7稳定细胞系[J]. 武警后勤学院学报(医学版), 2017(04):11-14. 高伟健, 朱一超, 郑幽,等. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系[J]. 生物技术通讯, 2020, ;(02):33-37+117. Huang M , J Wu, Ling R , et al. Quadruple negative breast cancer[J]. Breast Cancer, 2020, 27(4).