结核菌染色方法的研究进展论文

结核菌染色方法的研究进展论文

抗酸染色的原理 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质,主要是分枝菌酸,它包围在肽聚糖的外面,所以分枝杆菌一般不易着色,要经过加热和延长染色时间来促使其着色.但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后,就很难被酸性脱色剂脱色,故名抗酸染色. 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物,用盐酸酒精处理也不脱色.当再加碱性美兰复染后,分枝杆菌仍然为红色,而其他细菌及背景中的物质为兰色.

论文关键词： 结核病;化学治疗;药物

抗结核药物是结核病化学治疗(简称化疗)的基础，而结核病的化学治疗是人类控制结核病的主要手段。结核病化疗的出现使结核病的控制有了划时代的改变，全球结核病疫情由此得以迅速下降。最早出现的有效抗结核药物当数链霉素(SM)。它发现于20世纪40年代，当时单用SM治疗肺结核2～3个月后就可使临床症状和X线影像得以改善，并可暂获痰菌阴转。对氨水杨酸(PAS)被应用于临床后发现，SM加PAS的治疗效果优于单一用药，而且可以防止结核分支杆菌产生耐药性[1]。发明异烟 肼 (INH)后，有人单用INH和联用INH PAS或SM进行对比治疗试验，再一次证明了联合用药的优势[2]。于是在此基础上产生了著名的结核病“标准”化疗方案，即SM INH PAS，疗程18个月～2年，并可根据药源和患者的耐受性将PAS替换为乙胺丁醇(EMB)或氨硫 脲 (TB1)，俗称“老三化”[3]。70年代随着利福平(RFP)在临床上的应用以及对吡 嗪 酰胺(PZA)的重新认识，在经过大量的实验后，短程化疗成为结核病治疗的最大热点，并取得了令人瞩目的成就[4，5]。当人类迈入2000年的今天，抗结核药物的研究已经获得了更进一步的发展，其中最引人注目的主要是利福霉素和氟 喹 诺酮这两大类药物，尤以后者更为突出。

一、利福霉素类

在结核病的化疗史上，利福霉素类药物的研究一直十分活跃。随着RFP的发现，世界各国出现了研制本类新衍生物的浪潮，相继产生了数个具有抗结核活性的利福霉素衍生物，但杀菌效果都不如RFP，RFP仍是利福霉素类药物中最经典的抗结核药物。

1.利福布丁(rifabutin，RFB，RBU)：RBU对RFP敏感菌的最低抑菌浓度(MIC)是低的(< μg/ml)，而对RFP耐药菌株的MIC明显增高(～ μg/ml)。此结果显示RFP与RBU存在交叉耐药;这么宽的MIC范围，又提示RFP耐药菌株对RBU有不同程度的敏感性，敏感比例高达31%。在MIC< μg/ml的结核分支杆菌株，或许可把RBU考虑为中度敏感[6]。RBU的亲脂性、透过细胞壁和干扰DNA生物合成的能力高于RFP，使之能够集中分布在巨噬细胞内而具有较强的活性。

RBU也有其不足之处。如RBU的早期杀菌作用不如RFP[7]，可能与其血浆浓度低有关。有研究结果表明，RBU口服剂量300 mg 4 h后的峰值浓度仅为 μg/ml，比同剂量RFP的峰值约低10倍。究其原因，可能与RBU的口服生物利用度和血清蛋白结合率均低有关，前者只有12%～20%，后者仅为RFP的25%。

临床上已将RBU试用于不同类型的结核病人。香港胸腔协会的研究结果表明，在治疗同时耐INH、SM和RFP的结核病患者中，RBU和RFP的效果几乎相等[8]。但已有研究表明，RBU对鸟分支杆菌复合群有明显的作用。

2.苯并恶 嗪 利福霉素-1648(KRM-1648)：苯并恶 嗪 利福霉素-1648属于3-羟-5-4-烷基 哌 嗪 ，为苯并恶 嗪 利福霉素5种衍化物之一。本品比RFP的MIC强16～32倍。小鼠实验结核病治疗结果显示：单剂KRM-1648 3 mg/kg的疗效明显优于RFP 10 mg/kg，与HE联用亦比RFP HE疗效佳。KRM-1648和其它利福霉素类的交叉耐药也必然是一问题，但纲谷良一[9]认为：由于KRM-1648比RFP有更强的杀菌作用，即使结核分支杆菌对RFP具耐药性，本药也能发挥一定的杀菌作用。

最近芝加哥的一份动物实验研究结果表明，KRM-1648、RBU和RFP这三种相类似的药物均对耐多药结核病(MDR-TB)无效[10]。

3. 利福喷丁(rifapentine， DL473， RPE， RPT)：RPT又名环戊基 哌 嗪 利福霉素，于1976年由意大利Leptit公司首先报道，我国紧跟其后于1977年就已着手研制，并在1984年应用于临床。该药为RFP的环戊衍生物，据Arioli等[11]报告，其试管中的抗菌活力比RFP高2～10倍。本品口服后，胃肠道吸收良好，并迅速分布到全身组织中，以肝脏为最高，其次为肾、脾、肺及心脏，在脑组织中也有分布。人口服后4 h即达血浓度高峰。RPT的蛋白结合率可达98%～99%，因此组织停留时间长，消除半衰期时间亦较RFP延长4～5倍，是一种高效、长效抗结核药物。

我国使用该药替代RFP对初、复治肺结核进行了对比研究，每周顿服或每周2次服用RPT 500～600 mg，疗程结束时痰菌阴转率、病变有效率和空洞关闭率与每日服用RFP组相比，疗效一致，未见有严重的药物毒副反应。本药不仅有满意的近期效果，而且有可靠的远期疗效[12]。由于RPT可以每周只给药1～2次，全疗程总药量减少，便于督导，也易为病家所接受。

二、氟 喹 诺酮类(FQ)

第三代氟 喹 诺酮类药物中有不少具有较强的抗结核分支杆菌活性，对非结核分支杆菌(鸟胞分支杆菌复合群除外)亦有作用，为临床治疗开拓了更为广阔的前景。由于结核分支杆菌对氟 喹 诺酮产生自发突变率很低，为1/106～107，与其他抗结核药之间无交叉耐药性，目前这类药物已成为耐药结核病的主要选用对象。

氟 喹 诺酮类药物的主要优点是胃肠道易吸收，消除半衰期较长，组织穿透性好，分布容积大，毒副作用相对较小，适合于长程给药。这类化合物抗菌机制独特，通过抑制结核分支杆菌旋转酶而使其DNA复制受阻，导致DNA降解及细菌死亡。氟 喹 诺酮在肺组织、呼吸道粘膜组织中有蓄积性，浓度均超过结核分支杆菌的MIC。感染部位的组织浓度对血药浓度的比值较正常组织中高，在痰、支气管粘膜、肺等组织的药浓度/血清浓度为2或更高，显示了对肺结核的强大治疗作用。

1.氧氟沙星(ofloxacin， OFLX)：OFLX对结核分支杆菌的MIC约～2 μg/ml，最低杀菌浓度(MBC)为1～2 μg/ml，在下呼吸道的组织浓度远高于血清浓度。OFLX有在巨噬细胞内聚积的趋势，在巨噬细胞中具有与细胞外十分相近的MIC，与PZA在巨噬细胞中产生协同作用。OFLX与其他抗结核药之间既无协同作用也无 拮 抗作用，可能为相加作用[13]。

OFLX的临床应用已有若干报道，尽管人体耐受量仅有中等程度抗结核作用，但不论对鼠实验结核或人结核病治疗均有肯定疗效。现在香港将OFLX与其它可供使用的配伍药一起，常规用于少数耐多药的慢性肺结核病人[8]。

我院采用含有OFLX的化疗方案治疗耐多药肺结核，获得了痰菌培养2个月阴转率50%、3个月62%以及6个月75%的可观效果。厂家推荐的用于治疗严重呼吸道感染的剂量为400 mg 2次/日。有人对22例单用OFLX 300 mg/d或800 mg/d治疗，持续9个月到1年，所有病人耐受良好，并显示较大的剂量效果较好[6]。多次用药后，血清或各种体液中无临床上明显的蓄积作用，有利于肺结核的长程治疗。人体对OFLX的最大耐受量为800 mg/d，我院选择的经验剂量为300 mg 2次/日。

2.环丙沙星(ciprofloxacin，CPLX， CIP)：CIP对结核分支杆菌的MIC和MBC与OFLX相似，具有很好的抗菌活性，但由于有人认为该药在试管内和RFP一起应用有 拮 抗作用，所以临床应用的报道也还不多。CIP因胃肠吸收差，生物利用度只有50%～70%，体内抗结核活性弱于OFLX。基于上述因素，OFLX被更多地用于耐药结核病。

3.左氟沙星(levofloxacin， DR-3355， S-OFLX， LVFX)：1986年开发的LVFX为OFLX的光学活性L型异构体，抗菌活性要比D型异构体大8～128倍。在7H11培养基中，LVFX抗结核分支杆菌的MIC50、MIC90均为 μg/ml。在7H12培养基中对敏感菌及耐药菌的MIC为～1 μg/ml(MBC1 μg/ml，)，比OFLX强1倍。与OFLX一样，LVFX亦好聚集于巨噬细胞内，其MIC为 μg/ml(MBC是2 μg/ml)，抗结核分支杆菌的活性也是OFLX的2倍。两者之间之所以产生这样的差异，可能与它们抗DNA旋转酶的活性不同有关[14]。

LVFX口服吸收迅速，服药后1 h血药浓度达 μg/ml，达峰时间(±) h。服用LVFX 4 h后痰中药物浓度平均 μg/ml，高于同期平均血液药物浓度 μg/ml，证明本品在体内吸收后渗透入支气管-肺屏障的浓度极高。而且，该药的副反应发生率只有。LVFX良好的抗菌活性、优良的药物动力学和较高的安全性以及与其他抗结核药间的协同作用[15]，使LVFX正逐步替代OFLX而成为MDR-TB的主要治疗药物。

4.司氟沙星 (sparfloxacin， AT-4140， SPFX) 与洛美沙星(lomefloxacin， LMLX)：SPFX是现行氟 喹 诺酮类中抗结核分支杆菌活性较高的品种。SPFX的MIC为 μg/ml，MBC μg/ml，较OFLX和CIP强2～4倍，亦优于LVFX。采用SPFX 50 mg/kg(仅相当于OFLX的1/6)就完全能够控制鼠结核病，临床上为达到最佳治疗结核的效果，宜采用400 mg/d。但SPFX对脑脊液的渗透有限，单次口服200 mg后脑脊液中的药物浓度分别低于或 mg/L。

LMLX对结核分支杆菌亦具有活性，但弱于对其它革兰阴性菌和阳性菌的活性。用于抗结核的剂量为400 mg 2次/日，如治疗超过一个月的患者可改为400 mg 1次/日。Primak等对43例初治肺结核用本药或RFP联用其它抗结核药进行疗效对比，3个月的痰菌阴转率不逊于RFP组。

SPFX与LMLX和氟罗沙星(fleroxacin)一样，因光毒性，使其在临床上的应用受到一定限制。

5. 莫西沙星(moxifloxacin， MXFX， Bay12-8039)：MXFX因附加的甲基侧链可增加抗菌活性，属第三代 喹 诺酮药物。对结核分支杆菌的MIC为 mg/L，虽体外活性大致与SPFX和克林沙星(clinafloxacin)相当;体内如在鼠实验结核中，克林沙星无活性，而MXFX的杀菌力较SPFX更高[16]。MXFX对治疗结核具有一定的开发潜力。

尽管上述氟 喹 诺酮类药物具有较好的抗结核作用，但无论如何也不能和RFP相提并论[17]。由于氟 喹 诺酮类药物影响年幼动物的软骨发育，对儿童和孕妇的安全性至今尚无定论，原则上暂不考虑用于这二类人群。

三、吡 嗪 酰胺

PZA是一种传统的抗结核药物，后来对它的杀菌作用又有了新的认识。根据Mitchison[18]的新推论，虽治疗开始时病灶内大多数细菌存在于细胞外，但当其中某些菌引起炎症反应使pH下降，部分细菌生长受抑制，此时PZA较INH更具杀菌作用。所以在短程化疗开始的2个月中加用PZA是必需的，可以达到很高、几乎无复发的治愈率。目前国外正在研制新的吡 嗪 酸类衍化物[20]。

四、氨基糖苷类

1.阿米卡星(amikacin，AMK)：卡那霉素由于它的毒性不适合于长期抗结核治疗，已逐渐被AMK所替代。AMK在试管中对结核分支杆菌是一种高效杀菌药，对大多数结核分支杆菌的MIC约为4～8 μg/ml。肌注 mg/kg(相当于 g/50 kg)，1 h后平均血的峰浓度(Cmax)为21 μg/ml。美国胸科学会(ATS)介绍的肌注和静脉滴注的剂量均为15 mg/kg[6] ，并将AMK列入治疗MDR-TB的主要药物中。

尽管AMK的耳毒性低于卡那霉素，但在条件许可的情况下，应监测该药的血浓度以确保剂量足够但不过高。具体做法可考虑每月测定一次高峰血液药物浓度，推荐峰浓度(静脉注射30 min后，肌肉注射60 min后)为35～45 μg/ml，可据此进行剂量调节。如果患者年龄在60岁或以上时，需慎用，因为AMK对年老患者的肾脏和第八对听神经的毒性较大。

2.巴龙霉素(paromomycin)：巴龙霉素是从链霉菌(streptomyces rimosus)的培养液中获得的一种氨基糖苷类药物，有研究认为它具有抗结核作用[19]。Bates[20]则将其作为一种新的抗结核药物，并用于MDR-TB。

五、多肽类，结核放线菌素-N(tuberactinomycin-N，TUM-N;enviomycin，EVM)

结核放线菌素-N的'抗结核作用相当于卡那霉素的1/2，它的优点是对肾脏和听力损害比紫霉素和卡那霉素低。鉴于此药对耐SM或KM菌株有效，可用于复治方案。常用剂量为1 g/d，肌肉注射，疗程不超过3个月。上海市肺科医院临床应用的结果表明，密切观察下肌肉注射结核放线菌素-N 1 g/d 14个月，未观察到明显的药物副反应。

六、氨硫 脲 衍生物

较引人注目的是2-乙酰 喹 啉 N4吡咯烷氨硫 脲 ，MIC为 μg/ml，优于TB1。国内单菊生等报告的15种氨硫 脲 衍生物有4种具体外抗结核分支杆菌作用，MIC范围在～ μg/ml之间，其中以乙 烯 基甲基甲酮缩TB1对小鼠实验性结核病的疗效为著。

七、吩 嗪 类

这是一类用于麻风病的药物，近年来也开始试用于耐药结核病，其中对氯法齐明(氯苯吩 嗪 ， clofazimine， CFM， B663)的研究最多[21]。CFM是一种吩 嗪 染料，通过与分支杆菌的DNA结合抑制转录而产生抑制分支杆菌生长的效果，对结核分支杆菌和牛分支杆菌的MIC为～ μg/ml。一般起始剂量为200～300 mg/d，当组织饱和(皮肤染色)时减为100 mg/d。它的另外一个重要作用是与β干扰素合用，可以恢复由结核分支杆菌25片段引起的细胞吞噬和杀菌活性的抑制作用，从而成为吞噬细胞的激发剂，属于免疫治疗的一部分，已经超出了单纯化疗的范畴[22]。CFM可引起严重威胁生命的腹痛和器官损害，应予以高度重视[23]。

有人报道，在11个吩 嗪 类似物中有5个体外抗结核分支杆菌活性等于或优于CFM(MIC90≤ μg/ml)，其中以B4157最强(MIC90为 μg/ml)，但仍在进一步研究之中[21]。

八、β内酰胺酶抗生素和β内酰胺酶抑制剂

结核分支杆菌也产生β内酰胺酶，但β内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦在单用时并不能抑制结核分支杆菌的生长，而是通过抑制β内酰胺，使β内酰胺酶类抗生素免遭破坏[24]。当β内酰胺酶抑制剂与不耐酶的广谱半合成青霉素联合使用时，能大大增强这类青霉素的抗结核分支杆菌作用。其中的最佳联用当数氨 苄 西林或阿莫西林与克拉维酸的等摩尔复合剂[25]。一项27株结核分支杆菌的试管实验结果显示，阿莫西林单用时的MIC>32 mg/L，而与克拉维酸联用时MIC下降至4～11 mg/L，效果增加了2～7倍。这类代表性的复合剂有阿莫西林-克拉维酸(奥格孟汀，augmentin)，氨 苄 西林-克拉维酸和替卡西林-克拉维酸(特美汀，timentin)[26]。值得注意的是，氨 苄 西林加丙磺舒远远高于氨 苄 西林与克拉维酸联用时对结核分支杆菌的MIC90。如单用氨 苄 西林口服 g后的血清峰值为18～22 mg/L，加用1 g丙磺舒后可上升至25～35 mg/L。

由于β内酰胺酶类抗生素很难穿透 哺 乳动物的细胞膜而进入细胞内，有可能限制这类药物抗结核治疗的效果[27]。目前，这类药物的抗结核研究还限于实验阶段。

九、新大环内酯类

本类抗结核分支杆菌作用最强的是罗红霉素(roxithromycin， RXM， RU-28965)，与INH或RFP合用时有协同作用。其它还有甲红霉素(克拉霉素，clarithromycin， CAM， A-56268)和阿齐霉素(azithromycin， AZM， CP-62933)，主要用于非结核分支杆菌病的治疗[28]。

十、硝基咪 唑 类

近年来的研究认为，5-硝基咪 唑 衍生物作为新的抗结核药物具有相当好的开发前景。此类药物中的CGI-17341最具代表性，体外抗结核分支杆菌活性优于SM，可与INH和RFP相比拟，对结核分支杆菌的敏感菌株的MIC为～ μg/ml。实验动物中该药对感染结核分支杆菌小鼠的半数有效量(ED50)为 mg/kg，而INH和RFP的半数有效量分别为(～)和(～) mg/kg。其疗效与剂量显著相关，20、40、80 mg/kg的生存时间分别为(±) d、(±) d和(±) d。但是，5-硝基咪 唑 衍生物的抗结核研究尚未应用于临床。

十一、吩噻 嗪 类

吩噻 嗪 类中的氯丙 嗪 在早期的文献中报告能改善临床结核病，其浓度为～ μg/ml时能抑制巨噬细胞内结核分支杆菌，并增强SM、INH、PZA、RFP和RBU对抗细胞内结核分支杆菌的作用，该类药物中的 哌 嗪 衍生物三氟拉 嗪 (triluoperazine)，也有与之相类似的效果。

十二、复合制剂

抗结核药物复合制剂的研制主要是为了提高病人的依从性和增加药物的杀菌效果。复合制剂有杀菌剂与抑菌剂、杀菌剂与增效剂等多种形式，一般是两药复合，也有三药复合的情况。部分复合制剂的药效仅仅是单药累加效应，目的是提高病人的依从性;另一部分则不仅提高了依从性，也起到了增进药物疗效的作用。

在众多复合剂中，力排肺疾(Dipasic)是最为成功的一个品种，它以特殊方法将INH与PAS分子化学结合。动物实验结果显示，力排肺疾较同剂量INH的效果高5倍，亦明显高于以物理方式混合的INH加PAS，而且毒性低、耐受性良好、容易服用、耐药发生率低。近年来，国内已开始自行生产这类制剂，如结核清、百生 肼 、力康结核片和力克肺疾等。

力排肺疾的临床应用有两大趋势，一是用于耐药结核病，二是用于轻型儿童结核病。用于耐药结核病的理论依据是：自从短程化疗问世以来，临床上已很少使用PAS，可望结核分支杆菌对PAS有较好的敏感性;再就是二药分子化学结合而产生的增效结果。力排肺疾服用方便，毒副反应少，更适合于儿童结核病患者。

其它复合剂型还有卫肺特(Rifater，HRZ)和卫肺宁(Rifinah，HR)，这些复合剂只是物理性混合药物，本质上和组合药型类似。

已有的研究结果表明：使用复合剂的头8周痰菌阴转率为87%，高于单剂联合的78%;副作用前者为，低于后者的，但也有副作用以前者为高的报道;使用上复合剂较单剂联合更方便，有助于提高病人的可接受性[29]。

以上虽罗列了数大类药物在抗结核研究方面的进展，但应该认识到这些只不过是抗结核药物研究重新开始的序幕。因开发一种新的抗结核药物既需要财力和时间，还要评估其在试管和临床试用的效果，并非易事。从前一段时间看，由于发达国家的结核病疫情已经下降，而且认为已经有了有效的抗结核药物，而发展中国家无能力购置昂贵的药物，这些都是为什么尚无治疗结核病新药问世的一些理由。由于目前伴有HIV感染的结核病发病率增加和耐多药结核分支杆菌的出现，以及预料今后耐RFP菌株的发生率将会增高，所以导致急需迅速开发新的抗结核药物。抗结核新药的研究，在美国、欧洲和亚洲的实验室，已经从过去10年基本静止状态发展到一个活力相当大的时期。虽然Hansen疾病研究实验室筛选了可能用于抗结核的近5 000种化合物，但还没有发现高质量的化合物，而且该项目的因素评估工作还需要数年之久。何况即使在实验室初步证实有效的药物，用于人体是否有效和足够安全，尚待揭示，可谓任重道远。抗结核药物研究除直接开发新药外，还要认识到随着靶向释药系统的发展，利用脂质体或单克隆抗体作载体，使药物选择作用于靶位，增加药物在病变局部或细胞内的浓度，以改进疗效。文献早已报道了脂质体包埋的INH和RFP对鼠实验结核病的治疗取得良好效果。有人以携有吞噬刺激素(tuftsin)的RFP脂质体治疗实验鼠结核病，每周2次，共2周，使小鼠肺脏活菌数下降的效果比游离RFP至少强2 000倍，其疗效非同一般。目前脂质体虽尚无制剂上市供临床应用，但为今后提高难治性结核病的疗效、降低副反应，提供了令人鼓舞的前景。由此来看，未来结核病化疗的研究重点将仍在于寻找更为高效的杀菌剂或(和)灭菌剂，进而减少服药数量和服药次数、缩短化疗疗程、提高病人的依从性。

结核杆菌的检测方法论文

结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.一、结核杆菌DNA的提取在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应<约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.二、引物的设计根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.(一)编码结核杆菌抗原的基因序列1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.(二)结核杆菌基因组重复序列1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.(三)人型结核杆菌特异序列mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.(四)分枝杆菌dnaJ基因该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.(五)rRNA序列用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.三、PCR产物的检测方法通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性(一)PCR的特异性PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.(二)PCR的敏感性PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.五.PCR在结核病临床诊断中的应用PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.六、PCR在检测TB中的注意事项PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.

结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。 详细的检测方法生物帮上面有的，蛋白质互作

你好！ （一）漂浮法：1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。(二)沉淀法：1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入酚红指示剂毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。2. 矫正PH为，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。这样回答就可以了，我要是导师就给你满分了！

论文的研究方法和进展

论文的研究方法如下：

1、调查法：调查法是最基本常用的科学研究方法，包括问卷调查、资料收集、访谈等形式，对得到的大量资料进行比较、分析、总结、归纳，从而得出一般性结论。

2、文献研究法：根据研究目的需求，通过查阅文献获得资料，全面地、正确地掌握所要研究问题发展历史，研究进展和未来趋势的一种方法，是快速了解进展最为有效方法，也用来指导研究选题，挖掘坦山前沿热点等。

3、实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要，设计实验证实确定条件因素与此改现象之间的因果关系的活动。阐明自变量与某一因变量的本质关系。

4、定量分析法：以实际数据“量”化研究解析某一现象规律等差异，使人们对研究对象的认识精确化，利于科学地揭示规律，把握本质，并理清关系，结合数理模型可以预测事物的未来发展趋势。

5、定性分析法：对研究对象进行“质”的分析。具体运用到归纳和让扒中演绎、分析综合以及抽象概括等具体研究方法，进一步进行思维加工，以达去粗取精、去伪存真、由此及彼、由表及里，最终认识事物的本质、揭示纷繁复杂表象下的内在规律。

6、经验总结法：对过往大量实践活动进行归纳与分析，提升为一般性、系统性的经验理论方法。再经过不断的修正完善，指导自己和他人研究开展，经验水平与主体认知层次能力高低有很大关系。

论文研究的意义：

1、是前人没有研究过的，也就是说研究领域中一个新颖有意义的课题，被前人所忽略的。

2、前人有研究过，或者阐述过但阐述论证的不全面和有不足的地方，作者加以丰满，或者驳斥前人的观点。

论文的研究方法有哪些

论文的研究方法有哪些，研究方法是在一个研究中发现新的现象、新的事物，或者提出新理论、观点，论文研究方法需要大量阅读法，找到不足和创新点，来完善自己的论文，下面一起来学习一下论文的研究方法有哪些。

一、思维方法

思维方法是人们正确进行思维和准确表达思想的重要工具，在科学研究中最常用的科学思维方法包括归纳演绎、类比推理、抽象概括、思辩想象、分析综合等，它对于一切科学研究都具有普遍的指导意义。

二、内容分析法

内容分析法是一种对于传播内容进行客观，系统和定量的描述的研究方法。其实质是对传播内容所含信息量及其变化的分析，即由表征的有意义的词句推断出准确意义的过程。内容分析的过程是层层推理的`过程。

三、文献分析法

文献分析法主要指搜集、鉴别、整理文献，并通过对文献的研究，形成对事实科学认识的方法。文献分析法是一项经济且有效的信息收集方法，它通过对与工作相关的现有文献进行系统性的分析来获取工作信息。一般用于收集工作的原始信息，编制任务清单初稿。

四、数学方法

数学方法就是在撇开研究对象的其他一切特性的情况下，用数学工具对研究对象进行一系列量的处理，从而作出正确的说明和判断，得到以数字形式表述的成果。科学研究的对象是质和量的统一体，它们的质和量是紧密联系,质变和量变是互相制约的。要达到真正的科学认识，不仅要研究质的规定性，还必须重视对它们的量进行考察和分析，以便更准确地认识研究对象的本质特性。数学方法主要有统计处理和模糊数学分析方法。

一、规范研究法

会计理论研究的一般方法，它是根据一定的价值观念或经济理论对经济行为人的行为结果及产生这一结果的制度或政策进行评判，回答经济行为人的行为应该是什么的分析方法。

二、实证研究法

实证研究法是认识客观现象，向人们提供实在、有用、确定、精确的知识研究方法，其重点是研究现象本身“是什么”的问题。实证研究法试图超越或排斥价值判断，只揭示客观现象的内在构成因素及因素的普遍联系，归纳概括现象的本质及其运行规律。

三、案例分析法

案例分析法是指把实际工作中出现的问题作为案例，交给受训学员研究分析，培养学员们的分析能力、判断能力、解决问题及执行业务能力的培训方法，具体说来：

四、比较分析法

是通过实际数与基数的对比来提示实际数与基数之间的差异，借以了解经济活动的成绩和问题的一种分析方法。在科学探究活动中常常用到，他与等效替代法相似。

1、文献阅读法。通过网络资源、高校图书馆网络数据库资源、校图书馆馆藏图书等方式，获得与研究课题相关的文献资料。2、定性和定量分析相结合。一些如经济总量分析、人员迁徙、消费结构等涉及量化指标的分析，需采用定性和定量分析方法相结合的方式。对于行业和企业则多以官方统计数据和年报季报为基础，采用经济模型进行了定量分析。3、微观与宏观分析相结合。从宏观处着手，找到各类影响因素，然后再以某一行业为例，即从微观的角度，进一步论证其准确度。在此基础上，微观与宏观相结合的分析更加能够印证某一领域的发展状况和进展情况等。4、理论与实际分析相结合。论文研究必须经过一定的理论基础，但只有理论，论文显得枯燥，加上一些实际案例，比如以公司、实例为例，提出具有可操作性的对策，使研究结果建议更具有科学性。5、调查法。调查法是科学研究中最常用的方法之一。调查法中最常用的是问卷调查法，它是以书面提出问题的方式搜集资料的一种研究方法，即调查者就调查项目编制成表式，分发或邮寄给有关人员，请示填写答案，然后回收整理、统计和研究。

论文的研究方法和进展要求

（1）文献研究法根据所要研究内容 ，通过查阅相关文献获得充足的资料，从而全面地了解所研究课题的背景、历史、现状以及前景。（2）研究项目分析法在进行理论的搜集与分析之后，根据现有的研究项目整体系统进行分析与设计，实现理论与实践的相结合，使理论有理有据，设计更合理。

您好，常用的研究方法有以下几种：调查法 调查法是科学研究中最常用的方法之一。它是有目的、有计划、有系统地搜集有关研究对象现实状况或历史状况的材料的方法。调查方法是科学研究中常用的基本研究方法，它综合运用历史法、观察法等方法以及谈话、问卷、个案研究、测验等科学方式，对教育现象进行有计划的、周密的和系统的了解，并对调查搜集到的大量资料进行分析、综合、比较、归纳，从而为人们提供规律性的知识。 调查法中最常用的是问卷调查法，它是以书面提出问题的方式搜集资料的一种研究方法，即调查者就调查项目编制成表式，分发或邮寄给有关人员，请示填写答案，然后回收整理、统计和研究。 观察法 观察法是指研究者根据一定的研究目的、研究提纲或观察表，用自己的感官和辅助工具去直接观察被研究对象，从而获得资料的一种方法。科学的观察具有目的性和计划性、系统性和可重复性。在科学实验和调查研究中，观察法具有如下几个方面的作用：①扩大人们的感性认识。②启发人们的思维。③导致新的发现。 实验法 实验法是通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果联系的一种科研方法。其主要特点是：第一、主动变革性。观察与调查都是在不干预研究对象的前提下去认识研究对象，发现其中的问题。而实验却要求主动操纵实验条件，人为地改变对象的存在方式、变化过程，使它服从于科学认识的需要。第二、控制性。科学实验要求根据研究的需要，借助各种方法技术，减少或消除各种可能影响科学的无关因素的干扰，在简化、纯化的状态下认识研究对象。第三，因果性。实验以发现、确认事物之间的因果联系的有效工具和必要途径。 文献研究法 文献研究法是根据一定的研究目的或课题，通过调查文献来获得资料，从而全面地、正确地了解掌握所要研究问题的一种方法。文献研究法被子广泛用于各种学科研究中。其作用有：①能了解有关问题的历史和现状，帮助确定研究课题。②能形成关于研究对象的一般印象，有助于观察和访问。③能得到现实资料的比较资料。④有助于了解事物的全貌。 实证研究法 实证研究法是科学实践研究的一种特殊形式。其依据现有的科学理论和实践的需要，提出设计，利用科学仪器和设备，在自然条件下，通过有目的有步骤地操纵，根据观察、记录、测定与此相伴随的现象的变化来确定条件与现象之间的因果关系的活动。主要目的在于说明各种自变量与某一个因变量的关系。 定量分析法 在科学研究中，通过定量分析法可以使人们对研究对象的认识进一步精确化，以便更加科学地揭示规律，把握本质，理清关系，预测事物的发展趋势。 定性分析法 定性分析法就是对研究对象进行“质”的方面的分析。具体地说是运用归纳和演绎、分析与综合以及抽象与概括等方法，对获得的各种材料进行思维加工，从而能去粗取精、去伪存真、由此及彼、由表及里，达到认识事物本质、揭示内在规律。 跨学科研究法 运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行综合研究的方法，也称“交叉研究法”。科学发展运动的规律表明，科学在高度分化中又高度综合，形成一个统一的整体。据有关专家统计，现在世界上有2000多种学科，而学科分化的趋势还在加剧，但同时各学科间的联系愈来愈紧密，在语言、方法和某些概念方面，有日益统一化的趋势。 个案研究法 个案研究法是认定研究对象中的某一特定对象，加以调查分析，弄清其特点及其形成过程的一种研究方法。个案研究有三种基本类型：(1)个人调查，即对组织中的某一个人进行调查研究；(2)团体调查，即对某个组织或团体进行调查研究；(3)问题调查，即对某个现象或问题进行调查研究。 功能分析法 功能分析法是社会科学用来分析社会现象的一种方法，是社会调查常用的分析方法之一。它通过说明社会现象怎样满足一个社会系统的需要（即具有怎样的功能）来解释社会现象。 数量研究法 数量研究法也称“统计分析法”和“定量分析法”，指通过对研究对象的规模、速度、范围、程度等数量关系的分析研究，认识和揭示事物间的相互关系、变化规律和发展趋势，借以达到对事物的正确解释和预测的一种研究方法。 模拟法（模型方法） 模拟法是先依照原型的主要特征，创设一个相似的模型，然后通过模型来间接研究原型的一种形容方法。根据模型和原型之间的相似关系，模拟法可分为物理模拟和数学模拟两种。 探索性研究法 探索性研究法是高层次的科学研究活动。它是用已知的信息，探索、创造新知识，产生出新颖而独特的成果或产品。 信息研究方法 信息研究方法是利用信息来研究系统功能的一种科学研究方法。美国数学、通讯工程师、生理学家维纳认为，客观世界有一种普遍的联系，即信息联系。当前，正处在“信息革命”的新时代，有大量的信息资源，可以开发利用。信息方法就是根据信息论、系统论、控制论的原理，通过对信息的收集、传递、加工和整理获得知识，并应用于实践，以实现新的目标。信息方法是一种新的科研方法，它以信息来研究系统功能，揭示事物的更深一层次的规律，帮助人们提高和掌握运用规律的能力。 经验总结法 经验总结法是通过对实践活动中的具体情况，进行归纳与分析，使之系统化、理论化，上升为经验的一种方法。总结推广先进经验是人类历史上长期运用的较为行之有效的领导方法之一。 描述性研究法 描述性研究法是一种简单的研究方法，它将已有的现象、规律和理论通过自己的理解和验证，给予叙述并解释出来。它是对各种理论的一般叙述，更多的是解释别人的论证，但在科学研究中是必不可少的。它能定向地提出问题，揭示弊端，描述现象，介绍经验，它有利于普及工作，它的实例很多，有带揭示性的多种情况的调查；有对实际问题的说明；也有对某些现状的看法等。希望我的回答能够帮助到您！

研究方法，有很多种的，但写作一定要意思，先构思----------找资料-----写提纲------- 初稿----------------修改——正稿。这样的，但是抄袭肯定过不了，我们写10年原创，比较了解这方面的要求。

学术论文的写作技巧及要求

学术论文是专业工作者发表在学术刊物或学术会议上的论文。和其他的文章有较大的区别。根据我在中原职业技术学院做《学术论坛》主编工作的实践和体会，谈一谈学术论文的写作。

一、学术论文的特点

知识的专业性。学术论文都是从一个专业领域的学术需要出发，撰写的专业知识性较强的文献。它要求作者和读者都应具有某一方面的专业知识。

专业的创新性。学术论文是为交流学术上的新理论、新成就、新设想、新方法而写的。创新性是学术论文价值的根本所在，是衡量学术水平高低的重要标志。可以说，“创新”是学术论文的生命。

内容的科学性。学术论文所表述的内容必须真实、客观，能经得起实践的检验。绝不允许有丝毫的胡编乱造或弄虚作假。

结构的规范性。国家文献工作标准化技术委员会颁布了国家标准GB7713—87《科学技术报告、学术论文和学位论文的编写格式》，写作者必须遵守。

语言的双重性。学术论文既使用书面语符号系统，又使用辅助书面语符号系统。对书面语言的要求是准确、严密、精炼、平实。辅助书面语符号系统，如图、表、照片、符号、公式等。使用辅助书面语，是因为学术论文的内容不仅要求定性准确，还要求定量准确，能够真实、具体、准确地反映事物的本质、变化和结果。

二、学术论文的类型

根据研究对象和研究方法的不同，一般将学术论文分为三种类型：

理论型论文。这是以理论阐发为主的论文。其研究对象是广泛的自然现象或社会现象以及这些现象之间的联系。研究方法主要采用推理、理论证明、综合考察等。这类论文，有的提出某一概念或定义，有的论述某类事物的意义和影响，有的对原有理论做出补充和发展，有的推导出某个公式，等等。写作时务必注意理论推导的严密性。

实验型论文。这是对科学实验的观察记录和对其分析讨论的论文。目的在于通过对实验结果的分析讨论，探讨客观事物的本质和规律。写作时，要求把实验结果与理论分析结合起来，从而得出正确的有科学价值的结论。

描述型论文。这是对某种事物或现象进行客观描述和说明的论文。研究的主要方法是描述和比较。写作时要抓住研究对象内在的本质特征进行描述和说明，从而确认研究对象的科学价值。

三、学术论文的格式

根据国家标准GB 7713—87《科学技术报告、学术论文和学位论文编写格式》的规定，及目前国内外学术期刊的常规要求，基本格式是把整篇文章分为两个部分：

第一部分是“前置部分”。包括题名、作者姓名、作者单位、单位地址、邮政编码、摘要、关键词、中图分类号、文献标识码、文章编号。

第二部分是“主体部分”。包括前言、正文、结论、参考文献。

“摘要”有加英文翻译和不加英文翻译两种。若加英文翻译，有两种摆放形式：一种是摆放在“主体部分”后面。另一种是摆放在“前置部分”之后、“主体部分”之前。如用第二种摆放形式，还需要在“英文摘要”前面把“文章标题”和“作者单位名称”也用英文翻译出来。“作者姓名”和“地址”用汉语拼音字母拼写出来。邮政编码仍用阿拉伯数码标示。

四、学术论文的写作要求

题目。要力求用最简洁、最准确的语言概括文章的内容，或者揭示文章的论点。

作者姓名。写在文章题目下面一行的中间位置。“作者单位、地址和邮政编码”，写在作者姓名下面一行中间的位置，用圆括号括起。

摘要（即内容提要）。能使读者尽快了解全文的主要内容。摘要必须以高度概括且精确简练的陈述来反映全文的内容。一般200—300字。

关键词。是从文章中选取出来的最能代表文章中心内容或主题的词、词组、术语。它是一种能表达文献要素特征且具有实际意义的检索语言。一般选用3—8个关键词。关键词之间用分号隔开。

前言（又称引言或序言）。内容包括：本课题研究的渊源；国内外研究概况及最新进展情况；本课题研究的方法、目的、意义和价值；研究工作的大致过程及成果达到的预期效果等。

正文。是文章的主体和核心部分。学术论文的“创新性”主要在正文里体现。正文的水平决定着整个学术论文的水平。其写作要求，由于学术研究所涉及的学科不同，其选题、研究方法、结果和表述方式有很大差别。所以很难做出统一的具体规定。一般说：

实验型学术论文,正文的内容应包括实验、结果和讨论三个部分。

实验部分，要注意四点：（1）要用简明的语言叙述研究工作的情况，包括主要仪器设备的名称、规格，材料的制备、加工和纯化，或化学结构的鉴定方法等。（2）对实验方法、实验对象和实验程序应稍加详细地叙述。（3）要说明实验是在什么环境和条件下进行的。（4）写实验方法时要有详有略。前人的经典方法，只需一笔带过；若对前人的方法有改进，可加以说明；如属自己的创新，则需要详细地叙述。实验程序和实验数据可用图表表示。一些关键的仪器设备可用示意图或照片表示。这样，可以使人一目了然。

结果部分，主要写对本课题研究所取得的成果和理论分析。这是论文的核心和关键内容。实验结果应包括在实验中观察到的现象、测得的数据和图像、合成的新物质以及创造的新技术等。对实验结果要做出定性或定量的分析，引出必要的结论，并证明其正确性。

讨论部分，主要是对实验方法和结果两项内容进行综合分析、比较、论证。说明本课题研究成果的理论意义和实用价值。并将自己研究的结果与国内外对同类课题研究的结果进行比较，说明他们之间的异同，以体现论文的创新性。

理论型学术论文的正文结构，主要是根据研究课题的内容和学术本身的逻辑关系来确定的，没有固定的结构格式。

描述型论文，是对某种事物或现象进行说明的文章。和说明文的写法相近。正文内容，主要是抓住内在本质，通过描述和比较，说明和确认研究对象的科学价值。也没有固定的结构格式。

结论。是全篇的总结。它不是实验结果的简单重复，而是更深一步的认识。也就是在研究结果的基础上，进一步得出科学的结论，使研究由感性认识上升到理性认识。结论的内容包括：简明地概括本文解决了什么问题，发现了什么规律，获得了什么结果；评价研究结果的理论意义和实用价值；叙述研究结果与文献报道的异同点；简述研究工作还存在的.缺欠和需要进一步研究的问题。写的结论，必须措词严谨，逻辑性强，完整明晰。

参考文献。是向读者介绍引用的相关资料。一是尊重别人的成果；二是说明自己写作的依据、课题研究的渊源。引用的，必须是公开发表的文献。引用方法，按正文所引文献首次出现的次序，用阿拉伯数字为序数，并加方括号，标注在所引文字结尾处的右上角。然后按序数顺序排列在文章末尾。

五、学术论文的写作技巧

（一）怎样选择课题

选择课题是写作首先遇到的问题。选择好一个课题是学术论文成功的一半。怎样选择课题？要从以下几个方面着手：

明确选题原则。基本原则是选择有价值的课题。所选择的课题必须是现代化建设和国计民生所需要的，或者是在学术领域中需要研究和亟待解决的问题。

明确选题种类。通常把学术写作的课题概括为探求未知的课题、充实已知的课题、纠正通说的课题、学术讨论的课题、综合阐述的课题、科学普及的课题等。选择哪类课题，要根据自己的情况而定。

了解研究现状。即在同类研究中，现有什么成果，达到了什么程度，哪些问题尚未解决。要选择他人没有研究过的或虽有研究但尚未取得充分成果的问题。选择的课题要符合主客观条件。主观条件包括写作者本人的知识结构、研究能力、工作经验、兴趣爱好以及对课题理解的深度等。客观条件包括实验条件、协作条件、经费等。要选择那些主客观条件都比较充分的课题。

（二）怎样获得和选取资料

1、怎样获得资料。要写好一篇学术论文，必须围绕课题的需要，最大限度地获得资料。充足的资料，不仅是写好文章的基础，而且能引出可靠的结论和创新性的观点。常用的获得资料的方法是：

从实验中获得直接资料。实验型论文的资料，主要通过实验获取。

在观察中获得直接资料。根据研究的需要，有选择地对社会或自然界所发生的现象进行系统地细致地观察。把观察到的结果记录下来，就是资料。观察一定要全面。要把整体观察和局部观察、定点观察和变换角度观察、个别观察和比较观察、静态观察和动态观察结合起来。这样，就不会把个性误认为共性，把个别特有现象误认为是一般规律。

在调查研究中获得一手资料。根据写作的需要，深入到实际中去考察所研究的对象（包括自然的和社会的）。根据得到的资料，分析各种因素及其相互关系，从中发现事物的本质和规律。

从查阅文献中得到间接资料。查阅与写作有关的文献资料，不仅可以了解同类课题研究的历史与现状，而且可以了解他人从事该项研究的经验和教训。还能够较快地获得自己所选课题需要借鉴的新理论、新观点和新资料。

2、怎样选取资料。收集足够的资料之后，就要根据写作的需要，最小限度地选取资料。一要选取那些能充分表现主题、充分阐明观点的资料。二要选取新颖的资料。用新思维、新观点和新的方法论来充实研究的课题，使论文新颖夺目。三要确保资料的真实性。尽可能选取第一手资料。如果选取的是第二手资料，必须与原始资料核对，做到准确、无误。

（三）怎样构思

构思是写作者在掌握了足够资料的基础上，孕育文章的思维活动。包括主题的确立、题目的确定、结构的安排、提纲的编写等。也可以说是构想文章的蓝图。构思文章的过程也是疏通、理清思路的过程。一般说，有以下几个环节：

思考一个最佳标题。方法：可以想出几个，罗列下来，经过比较，确定一个。待文章写完后再进行修改。

思考出明确的论点。把总论点（中心论点）和分论点都固定下来。这些论点如何摆布也思考清楚。

思考文章的结构。结构是文章的内部组织与构造。思考结构就是要解决文章的“组织安排”。前面讲过学术论文的写作格式。“格式”和“结构”是两个不同的概念。“格式”是一定的规格式样；“结构”是各个组成部分的搭配和排列。“GB7713—87国家标准”虽对学术论文的格式进行了规范，但绝不是把结构也“统一”了。应该是：格式固定，结构各异。

思考所选取的资料。也是对选取的资料进行分类、集中、加工、提炼的过程。有两种方法：一种是发散性思考。就是围绕一个论点，把能说明这个论点的资料都集中到一起。另一种是收束性思考。就是把围绕每一个论点聚拢起来的一堆一堆的资料，再进行加工和提炼。既起到对资料精选的作用，又能使感性认识经过分析、判断和推理，上升为理性认识。

思考写作提纲。对上述几个问题思考的过程，也是腹拟提纲的过程。把所思考的问题逐条记录下来，反复推敲、修改，搭起文章的基本框架，就是文章的结构，也就是写作提纲。

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溶菌酶的研究进展及应用论文

随着时代的不断变化与发展,我国传统的畜牧行业展开了相应的改革,我国的畜牧兽医行业也有了进一步的提升。下文是我为大家整理的关于畜牧兽医本科生毕业论文下载的范文，欢迎大家阅读参考!

浅析猪常见传染性疾病临床症状和预防治疗方法

1 猪副伤寒病

本病主要侵害 1～4 月龄仔猪，一年四季均可发生，但阴雨潮湿季节多发。病猪和带菌猪是主要传染源，可从粪、尿、乳汁、流产的胎儿、胎衣、羊水排菌，主要经消化道感染。在子宫内也可能感染。健康猪带菌相当普遍，当受外界不良因素影响以及抵抗力下降时，常导致内源性感染。主要特征是腹泻、下痢，若不及时准确治疗，很快就脱水死亡，死亡率高，经济损失大。

猪副伤寒病的症状

急性型：多发生于断乳前后的仔猪，常突然死亡。病程稍长，体温高达 41℃～42℃，腹泻，下痢，呼吸困难，耳根、胸前、腹下皮肤有紫斑，多以死亡告终。

亚急性和慢性型：表现体温升高，眼结膜发炎，有脓性分泌物。初便秘后腹泻，排灰白色或黄绿色恶臭粪便。病猪消瘦，皮肤有痂状湿疹。病程可达数周，最终死亡或僵猪。

防治措施

预防：加强防疫注射或投喂副伤寒苗。把好猪源关，自繁自养极佳。改善饲管及卫生条件，消除发病诱因，增强仔猪抵抗力。常洗用具、食槽，保持圈舍清洁、干燥，不留粪尿，以减少感染机会。

哺乳及培育仔猪防止舔食脏物，喂优质、易消化饲料，勿突然更换饲料。

治疗：肌注恩诺沙星、盐酸环丙沙星，服土霉素片;肌注氯霉素、庆大霉素，服土霉素片;肌注氯霉素、磺胺嘧啶钠，服土霉素片;肌注恩诺沙星、氯霉素，服土霉素片;盐酸环丙沙星、氯霉素，服土霉素片。

2 猪肺疫病

猪肺疫是多杀性巴氏杆菌感染引起的一种急性、败血性传染病，各龄猪均可感染发病，其特征是急性病例呈败血症死亡。本病对多种动物和人均有致病性，猪最易感，季节性不明显，以冷热交替，气候剧变，高温，潮湿，多雨季节多发。营养不良、长途运输、饲养条件不良等因素促进本病发生, 一般呈散发性或地方性流行。

猪肺疫的症状

急性病例高热达 41℃~42℃，呼吸困难，犬坐姿势，咳喘，口鼻流泡沫或清液，咽喉部急性肿大、红色、触诊坚硬有热痛感。腹侧、四肢内侧皮肤发红斑，指压褪色，终呼吸困难窒息而死;慢性病例主要呈现慢性肺炎、慢性胃肠炎症状，鼻流脓性分泌物，持续性咳嗽、呼吸困难，食欲不振，伴腹泻消瘦。

防治措施

预防：定期注射猪肺疫苗;把好猪源关;猪舍定期消毒，保持干燥、卫生、通风;发现病例及时隔离治疗。

治疗：静注磺胺嘧啶钠。肌注长效土霉素、恩诺沙星或卡那霉素，若并发它病要对症治疗。

3 猪传染性胸膜肺炎

病原是胸膜肺炎放线杆菌，各龄猪均易感，多发于 6 周龄至6 月龄猪。长途运输、饲管不当、气候骤变等因素可引发本病。病猪和带菌猪为主要传染源，主要经呼吸道气流感染。

猪传染性胸膜肺炎的症状

感染猪潜伏期 1～7 天。按病程长短分最急性型、急性型、亚急性型和慢性型。最急性型病猪突然死亡，死前无征兆，死猪腹部、耳、四肢发绀，口鼻流带血红色泡沫，死亡率高达 80%～100%。急性型病猪减食或废绝，体温 41℃左右，常站立或呈犬坐姿势不卧，精神沉郁，耳鼻、四肢皮肤呈蓝紫色，张口伸舌，喘，间歇性咳嗽，呼吸困难，表情极痛苦，常于 24 小时内病重窒息死亡，部分转为亚急性或慢性。亚急性型或慢性型病猪体温正常或稍高，咳喘，食欲减退，消瘦，病程延长或进一步恶化。

防治方法

预防：加强防疫，定期注射胸膜肺炎多价灭活苗;严把猪源关;强化饲养管理;严格消毒制度，保持圈舍清洁、干燥、通风;实行全进全出的饲养方式，发现病猪及时隔离治疗。

治疗：本病早期治疗效果较好，用药量要大。首选静注磺胺嘧啶钠，肌注长效土霉素、恩诺沙星或(卡那霉素、丁胺卡那霉素)。

可同时使用维 C、地米效果会更好。若并发其他病要对症治疗。

4 猪口蹄疫

口蹄疫属于一种急性、烈性的传染病，猪、牛、羊等偶蹄动物均易感染，本病传染性很强，无明显季节性，一年四季均可发生。以流涎，跛行，口腔、鼻盘、蹄部水疱为主要特征。

猪口蹄疫的症状

患病猪体温升高，全身症状明显，流涎，跛行，喜卧，鼻盘、口腔、齿龈、舌、乳房(主要是哺乳母猪)，蹄冠、蹄叉、蹄踵均会产生水疱，疱溃后、流脓血而形成烂斑，重者蹄壳脱落，病仔猪可因停食、肠炎腹泻等死亡。

防治方法

若发现猪患上口蹄疫，一定要上报动物检疫部门，不能隐瞒、出售、私屠乱宰;对病死猪要作焚烧、深埋等无害化处理;对圈舍、用具、槽子等进行严格的清洗消毒，以免口蹄疫经空气、污物、病肉等传播，传染给其他家畜甚至人。该病危害极大，无法根治，只能预防。因此预防十分关键，广大养殖户要十分重视，定期注射口蹄疫苗，切勿心存侥幸，造成重大经济损失。

5 猪丹毒病

该病是由猪丹毒杆菌引起猪的一种传染病。多发生在夏秋和梅雨季节，2 月龄以上猪最易感染。病猪潜伏期短的为 3~5 天，长的达半月之久。主要特征是在耳后、颈部、胸、腹侧等部位，皮肤出现各种形状红斑或疹块，呼吸困难，病死率很高，对养猪业危害很大。

猪丹毒病的症状

该病分为败血型、疹块型和慢性型。患猪体温升高，精神不振，食欲减退或废绝，口渴，大便干燥。在耳根、胸、背部、腹部、大腿上均出现形状不一、大小不一、界限明显、扁平肿胀的紫红色疹块，指按褪色。

防治措施

预防：定期预防注射猪丹毒苗。强化消毒制度，搞好圈舍卫生。严把猪源关，新购进的猪应隔离饲养一周，确定正常后再入圈喂养。

治疗：静注磺胺嘧啶钠，用复方氨基比林或安乃近 10~20 毫升稀释青霉素肌注，每天 2 次;中药疗法可用大黄、石膏、玄参、知母、连翘、地龙各 25 克，甘草 15 克，加水煎服 2 剂。

浅谈奶牛乳腺炎治疗新策略研究进展

乳腺炎(mastitis)是奶牛最常见的生产性疾病，给奶牛业造成了巨大的经济损失[1].奶牛乳腺炎分临床型和隐性乳腺炎两种，临床型乳腺炎以乳房红肿热痛、乳腺组织损伤为主要特征[2],而隐性乳腺炎虽无可见临床症状，但在大部分牛场存在，危害更大。奶牛罹患乳腺炎后，引起乳腺上皮细胞合成和分泌功能不同程度障碍，乳脂肪、乳蛋白和乳糖等主要乳成分合成量明显减少[3],造成牛奶品质显着下降。研究证实，综合评估各种因素造成的损失，奶产量及奶品质下降造成的损失占总损失的49%[1].

国内常见的奶牛乳腺炎治疗方法是使用抗生素，但由于乳腺炎病原菌种类多，乳腺感染致病机制复杂，其治疗效果不理想。长时间大剂量使用抗生素极易导致耐药菌株增多、乳中抗生素残留等问题，严重威胁乳品及生命安全。因此，开发能快速修复乳腺组织，恢复产奶量、提高奶品质的治疗方法迫在眉睫。

研究表明，乳酸链球菌素、Aegis溶菌酶、溶葡萄球菌酶、CpG-DNA、血小板浓缩液新型乳腺炎治疗制剂可用于奶牛乳腺炎临床治疗。另外，激素、调控乳腺细胞信号通路及嗜中性粒细胞数量等新型治疗策略也为快速高效防治乳腺炎提供了良好前景。

1治疗乳腺炎的新制剂

乳酸链球菌素

乳酸链球菌素 (Nisin)又称乳球菌肽或乳链菌肽，是从乳酸链球菌发酵物中提取的一种多肽抗菌类物质，已被证明是一种安全天然生物性食品防腐剂和抗菌剂[4].Nisin最先作为牛乳房乳头的一种消毒剂使用，具有良好的杀菌作用且无潜在组织损伤。Nisin作为乳腺炎治疗药物的主要作用机理是其吸附于细胞膜上以后，破坏细胞膜的完整性，引起细胞裂解及细胞内蛋白大量外泄，致病原菌死亡[5].

另外的研究也证实，Nisin在肺炎链球菌感染小鼠模型的治疗中，也起到良好的杀菌作用。从临床型奶牛乳腺炎分离出金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和无乳链球菌的药敏试验结果可见，Nisin能够有效抑制这两种细菌的生长和繁殖[4].曹立亭等[6]使用Nisin乳腺灌注治疗临床型乳腺炎，测定治疗前后牛奶中乳脂肪含量、非脂乳固体含量、牛奶蛋白质含量、奶牛泌乳性能等指标，治疗后奶牛所产牛乳的上述指标均显着提高，提示使用Nisin可促进乳腺上皮细胞合成乳成分的能力增强及乳腺组织修复。Szweda P等[7]分离出37株牛乳腺炎源耐药菌株，药敏结果显示其中21株对Nisin敏感，进一步证明Nisin具有良好的杀菌作用。

Aegis溶菌酶

Aegis溶菌酶是一种有效的抗菌剂，能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-l,4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下致细胞胀裂，引起细菌裂解[8].通过对比溶菌酶和头孢唑啉钠治疗临床型乳腺炎的治疗效果试验，溶菌酶组给药24h后乳清中丙二醛(malondialde-hyde,MDA)含量显着降低，揭示溶菌酶能抑制和清除炎症时产生的氧自由基，从而减少对乳腺细胞的损伤[9].进一步研究证实，鸡蛋清溶菌酶、鸭蛋清溶菌酶、10%溶菌酶制剂、细菌性溶菌酶对引起奶牛乳腺炎的葡萄球菌均有抑制作用[10],细菌性溶菌酶治疗效果最好，最有希望用来治疗细菌性乳房炎。

沈诚等[11]将人溶菌酶重组质粒pcDNAKLYZ乳腺灌注治疗隐性乳腺炎奶牛，比较灌注前后牛乳中的细菌阴性率，灌注前阴性率为0,灌注后阴性率为,显示重组质粒抑菌效果显着，该重组质粒对奶牛隐性乳腺炎具有较好的治疗效果。

溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶(lysostaphin)是一种从模仿葡萄球菌()中分离获得的含Zn2+内切肽酶，因能有效的清除金黄色葡萄球菌生物被膜而达到杀菌作用[12].Aguinaga A等[13]使用溶葡萄球菌酶和不同抗生素单独和联合使用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant )和甲氧西林敏感菌(methicillin-susceptible )的研究报告中显示，溶葡球菌酶跟抗生素联合使用比单独使用抗生素，具有较强的杀菌作用并且致MSSA及MRSA菌株的抗生素使用浓度分别降低了2倍~11倍和2倍~14倍。在另一研究中，用MRSA建立小鼠肺炎模型，分别应用不同剂量的溶葡萄球菌酶、万古霉素和PBS进行感染后治疗，结果显示溶葡萄球菌组具有低病死率、肺组织损伤减少、感 染 部 位 细 菌 数 较 少 特 征，并 成 剂 量 依 赖性[14].

Szweda P等[7]研究同时也指出耐药菌对溶葡球菌酶的最小抑菌浓度(minimal inhibitory con-centration,MIC)为μg/mL~μg/mL,远远小于MIC最大值32μg/mL,且所有耐药菌对溶葡萄球菌酶敏感。蒋司嘉等[15]使用低、中、高重组溶葡球菌酶粉治疗85头患乳房炎奶牛的104个乳区，试验结果表明低中高剂量重组溶葡萄球菌酶均能有效清除感染乳区的链球菌、葡萄球菌、化脓隐秘杆菌等革兰阳性菌，大幅降低牛奶中的白细胞数，提高日产奶量。不同剂量的重组溶葡萄球菌酶治疗隐性乳房炎、临床型乳房炎的有效率和治愈率都优于青霉素，治疗效果跟剂量呈正相关。

CpG-DNA

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的CpG-ODN和自然界中低等生物的基因组DNA[16].在由大肠埃希菌建立的山羊乳腺炎模型中，试验组乳腺组织中大肠埃希菌数显着低于对照组，CpG-ODN对大肠埃希菌诱导山羊乳腺炎的乳腺有保护作用[17].在分别由金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌诱导的大鼠乳腺炎中，使用CpG-DNA的试验组乳腺组织白细胞介素-6(in-terleukine-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(tumor necro-sis factor-ɑ，TNF-ɑ)和CpG-DNA特 异 性 受 体TLR-9(Toll-like receptor-9)mRNA表达水平较对照组显着提高，同时减轻炎症反应和炎症介质对组织的损伤，提示CpG-DNA具有乳腺保护作用，其作用机理可能为CpG-DNA与宿主体内天然免疫细胞上的模 式 识 别 受 体 相 结 合，引 起 相 应 的 免 疫 应答[18].

血小板浓缩液

血小板最常见的作用是在血管损伤部位聚集，形成凝血酶原和纤维蛋白原组成凝血表面从而达到止血作用[19].Pinto J M等[20]通过使用血小板浓缩液治疗一例人慢性皮肤溃疡，观察到肉芽组织增生，提示治疗有效，可能原因是血小板作为生长因子的载体刺激胶原蛋白产生、活化成纤维细胞和诱导细胞外基质重塑达到修复组织损伤作用。

Lange-Con-siglio A等[21]使用血小板浓缩液灌注感染乳腺，通过感染乳腺乳汁体细胞数和细菌数评估治疗效果，结果显示使用血小板浓缩液能显着降低牛乳中体细胞数和细菌数，血小板浓缩液在促进炎症消散、减少乳腺实质损伤、降低乳腺炎复发率方面有较好作用。进一步研究证实血小板浓缩液不仅对乳腺组织有修复作用，对奶牛乳腺炎病原菌也有抑制作用。

Bi-elecki T M等[22]采用Kirby-Baue纸片扩散法，观察到人富含血小板的血浆的琼脂平板可以显着抑制金黄色 葡 萄 球 菌 及 大 肠 埃 希 菌 的 生 长。

Marian E等[23]从事的另一项研究不仅验证了上述研究结果，而且显示血小板浓缩液对铜绿假单胞菌也有抑制作用。一项乳腺炎流行病学调查的研究显示，金黄色葡萄球菌乳腺炎发病率为,大肠埃希菌乳腺炎发病率引起的为[24],因此有望使用血小板浓缩液治疗由条件致病菌引起的乳腺炎。

2乳腺炎治疗新策略研究进展

激素调控乳腺细胞的分泌及修复

激素在生殖生理方面应用广泛，乳腺的生长发育和分泌功能均在大脑皮层和丘脑下部的调节下进行，多种内分泌激素发挥着重要作用[25-26].佟慧丽等[27]建立正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系，用催乳素处理体外培养乳腺上皮细胞，测定催乳素处理组乳腺上皮细胞乳糖和总蛋白水平，显示催乳素诱导乳腺上皮细胞乳糖及乳蛋白分泌水平明显升高。

陈建晖等[28]使用催乳素和孕酮处理奶牛乳腺上皮细胞系，测定处理后细胞中的酪蛋白和乳糖含量，显示催乳素处理组升高趋势显着，提示催乳素可以提高乳腺干细胞的数量。激素已被证实有助于提高乳腺细胞分泌能力，提高牛乳品质，促进乳腺组织恢复，但应用方法及其作用机制有待进一步研究。

调控乳腺细胞凋亡及相关信号通路的研究

研究证实乳腺炎的发生发展与乳腺细胞的凋亡及信号通路关系密切，肖阳[29]使用TUNNEL方法检测奶牛不同发育时期乳腺组织的细胞凋亡，证实泌乳晚期凋亡信号最强。乳腺细胞的分化、更新及凋亡与信号通路的调控联系紧密，与此相关的信号通路包括Wnt信号通路、Notch信号通路、Hedge-hog信号通路[26].Wnt信号通路中，β-catenin可以启动Wnt靶基因的表达;抑制β-catenin信号，乳腺细胞分化和增殖被抑制，Notch信号通路的激活能够促进乳腺细胞的自我更新，而Notch的过量表达会抑制细胞的分化。研究表明不同形式的TP63激活Hedgehog信号通路可促进乳腺细胞的有丝分裂[30].张雯[31]使用脂多糖(LPS)诱导的原代小鼠乳腺上皮细胞炎症模型，检测LPS刺激下细胞因子和炎性介质的分泌以及常见的两条炎症信号转导通路NF-κB和MAPK的变化，结果显示LPS刺激下，乳腺上皮细胞TRL4、NF-κB和下游细胞因子表达升高，显着抑制了p38、JNK和ERK、MAPKs磷酸化。分析各信号通路在乳腺细胞分化更新及凋亡中的机制，精细调控乳腺细胞凋亡也有望成为治疗乳腺炎的新方向。

调控乳腺组织嗜中性粒细胞数量的研究

金黄色葡萄球菌()等致病菌侵入奶牛乳腺后，中性粒细胞向感染乳腺组织集中，发挥吞噬功能清除病原，充当保护机体的第一道防线[32].然而，如果PMN在炎症灶过度激活或延迟清除，大量PMN可以通过释放氧自由基等有害内容物加重炎症反应，使炎症迁延、慢性化或扩散至全身[33].因此适时适度清除PMN对于控制乳腺炎症的发展和转归至关重要。

Wang Y等[34]使用650nm,低强度激光疗法作用LPS诱导的大鼠乳腺炎模型，经低强度激光疗法后，抑制PMN向乳腺腺泡聚集，降低髓过氧化物酶活性，从而减轻乳腺炎症反应。另一项研究证实，日粮中硒含量与乳腺中PMN数量直接相关，LPS诱导的小鼠乳腺炎的病理学切片显示，缺硒小鼠乳腺出现较多PMN浸润、乳腺中组织中促炎因子表达水平高于正常硒含量组小鼠，因此有望通过调控日粮中硒含量，调节乳腺中PMN数量，进而防治奶牛乳腺炎[32].

综上所述，乳腺炎是一种严重危害奶牛业的疾病，抗生素治疗乳腺炎由于其天然局限性，治疗效果并不理想。乳腺炎防治新制剂乳酸链球菌素、Aegis溶菌酶、溶葡萄球菌酶、CpG-DNA、血小板浓缩液有望替代传统治疗药物;激素疗法、调控信号通路及PMN数量有望作为预防治疗乳腺炎的新策略。积极开展牛乳腺炎治疗新制剂及新策略的研究，为高效防控奶牛乳腺炎提供良好条件。

参考文献：

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[2]宋亚攀，杨利国。中国奶牛乳腺炎防治研究进展[J].中国奶牛，2010(12)：48-54.

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róng jūn méi

lysozyme

溶菌酶是一种低分子量（14700道尔顿）的、不耐热的堿性蛋白质，其中富含精氨酸。溶菌酶为正常机体免疫防御机制的组成部分。因具有溶解细菌细胞壁的作用而得名，是能溶解某些细菌的一种糖水解酶。溶菌酶主要存在于动植物的组织液和某些微生物体内，如鼻粘液、眼泪、唾液、卵蛋白、枯草杆菌培养物和某些蔬菜中。该酶能水解细菌的细胞壁中N乙酰氨基葡萄糖和N乙酰胞壁酸之间的β1，4糖苷键，故又称胞壁质酶，即N乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。现从鸡蛋清提取溶菌酶以及从霉菌中提取溶菌酶均已达工业化生产水平。对鸡蛋清溶菌酶的研究较详细，它是由129个氨基酸残基构成的一种堿性蛋白，分子量从～万，对热稳定，对堿不稳定，对革兰氏阳性细菌有较强的杀菌作用。

在人体内，溶菌酶存在于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞内；也存在于黏膜分泌液中，成为体表防御因素之一。体内多数器官含有一定浓度的溶菌酶。以乳汁、唾液、肠道以及吞噬细胞溶酶体颗粒中含量较多，组织中含量较少。正但肾脏和脾脏的含量较多。单核细胞与巨噬细胞的溶菌酶位于细胞表面，故其释放活跃。而中性粒细胞的溶菌酶位于胞质深层，只在细胞裂解时才释放出来。正常的尿液、汗液及脑脊液中不含溶菌酶。某些疾病患者血清或体液内的溶菌酶活性值有显著差别，故测定溶菌酶活性日益受到临床重视。

溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌细胞壁中乙酰葡糖胺与乙酰胞壁酸分子间的连接，使细胞壁破坏，水分进入，细胞崩解。而革兰氏阴性菌细胞壁粘肽层外有一层脂多糖和脂蛋白，故不受溶菌酶的影响。在抗体存在下，脂多糖及脂蛋白受到破坏时，溶菌酶才能发挥作用；在有抗体、补体、溶菌酶共同存在时，其溶菌作用更为明显。

溶菌酶也存在于鸡蛋清和某些细菌中，可用工业生产的方法将其提纯并加工制成各种制剂，用来治疗中耳炎、咽喉炎、副鼻窦炎等慢性疾病。

溶菌酶可药用，具抗菌、清除局部坏死组织、止血、消肿、消炎等作用。在食品工业上可用作防腐剂，还可添加在牙膏中作为防治龋齿的药用牙膏。在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于存作细胞壁，制备无菌体提取液。

球蛋白G ,溶菌酶

Lysozyme,Globulin G

有抗菌、抗病毒、止血、消肿及加快组织恢复功能等作用，故临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。

口服：每次3～5片（肠溶片），1日3次。口含：每次1片，1日4～6次。外用：用等渗盐水或注射用水或甘油配成1％～2％溶液外搽。治水痘时，每日每千克体重10mg，分3～4次服。

片剂（肠溶片）：每片10mg。口含片：每片20mg。

正常人尿中无溶菌酶。某些疾病患者血清或体液内的溶菌酶活性值有显著差别，故测定溶菌酶活性日益受到临床重视。常用的方法有琼脂平板法、比浊法。

Lysozyme

血液生化检查 > 酶类测定

血液

（1）琼脂平板法：根据溶菌酶能使革兰阳性菌细胞壁溶解，尤以对腐生菌。如溶壁微球菌（M．lysodeikticus）最为敏感，故常以溶解溶壁微球菌为指标，可对溶菌酶的活性进行测定。溶壁微球菌与琼脂混合，被检物（含溶菌酶）与该菌作用后，细菌因细胞壁破坏而溶解。致使加样孔周围出现溶菌环。溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数成直线关系。

（2）比浊测定法：一定浓度的混浊细菌溶液中，由于溶菌酶水解细菌细胞壁黏多肽使细菌裂解，浓度降低，透明度增强，根据浊度变化来推测溶菌酶的含量。

同琼脂平板法和比浊法测定。

同琼脂平板法和比浊法测定。

血清：5～30mg/L（琼脂平板法）；～14mg/L（比浊测定法）。脑脊液：0mg/L（琼脂平板法）。唾液：30～70mg/L（比浊测定法）。尿液：0mg/L（琼脂平板法）；1～3mg/L（比浊测定法）。

由于方法与实验条件不同，测定结果有所差别，故各实验室应建立自己的正常值标准。

血清溶菌酶测定对鉴别各型急性白血病有一定意义，急粒与急单血清溶菌酶升高；而急淋、急性红白血病降低或正常；经化疗奏效病情缓解后，溶菌酶水平可恢复。血清溶菌酶测定可作为判断局限性肠炎活动性的一个有用的指标，并且有助于判断临床过程的严重程度和对治疗的反应。

尿液溶菌酶含量增高的原因有：①肾小管损害；②高溶菌酶血症；③肾组织破坏。临床上测定尿液溶菌酶主要是作为肾小管损害的一个指标，各种原因的肾小管损害都可引起尿溶菌酶含量增高。肾移植患者定期检查尿溶菌酶活性十分必要。如移植肾接受良好，则溶菌酶活性在7天内恢复正常；若尿中过多的溶菌酶持续存在，必须疑及排斥反应的发生。

细菌性脑膜炎患者脑脊液（CSF）溶菌酶含量远较病毒性脑膜炎患者的含量高。因此，用溶菌酶测定对二者的鉴别有重要意义。此外。CSF溶菌酶测定对中枢神经系统的原发性或继发性肿瘤有一定辅助诊断价值。

慢性支气管炎患者痰液中溶菌酶含量降低；重症肺结核、泌尿系统感染患者血清或尿液中溶菌酶活性均可显著升高。此外，溶菌酶含量测定亦可作为判断局限性肠炎活动性指标。并有助于对临床过程的严重程度和治疗反应进行评价。

有关标本保存期限、溶菌酶标准液的保存时间，文献资料众说不一。一般地说，标本应新鲜，溶菌酶标准液应在临用时准确配制，测定检样中溶菌酶活性。目前已有用抗人溶菌酶抗体建立的溶菌酶免疫测定法。由测酶活性改为测酶含量，初步认为此法具有特异、灵敏、准确等优点。