外语论文检测

外语论文检测

要说专业的英语论文查重系统，应该非Turnitin莫属了吧，连页面都是全英文的，不过在页面的左上角可以把页面语言调成简体中文或者其他语言。这款英语论文查重系统主要是国外的用户，国内之所以能用，是因为国内有Turnitin的代理公司。因为本身就是查重英语论文的，所以Turnitin的英文资源会更丰富一些，专业性更强，更适合用来查重英语论文。Turnitin论文查重系统有四个版本，分别是国际版、UK版、Grammarly语法检测、iThenticate职称版，支持四种不同类型的论文查重。大家想用iThenticate查重英语论文可以直接去他们的官网，搜名字就能找到，如果不知道怎么注册使用，也可以去上进行提交，操作更简单一些，查重费用和结果都是一样的。

一般来说，Turnitin等查重软件会将论文中的文本进行分段和比对，然后计算出每个文本段落的相似度，最终将所有文本段落的相似度加权计算得到论文的总相似度和重复率。如果论文的相似度超过一定阈值，该论文可能被判定为存在抄袭问题。

英文论文查重通常采用的是Turnitin软件；查重一般是通过与已有的学术文献、网络文本等进行比对，检测论文中的相似度和重复率。具体的算法和计算方法是由该软件自行设计和实现的，而且每个软件的算法和计算方法也不尽相同。

在编写论文时，为了避免论文被查重软件判定为存在抄袭问题，应该避免直接复制粘贴他人的文本，同时也要注意参考文献的引用格式和标准。如果论文被查重软件判定为存在抄袭问题，应该及时修改和调整论文内容，确保其符合学术道德和规范。

咱们国家大多数的高校英文论文一般是规定要知网或者是Turnitin这两个检测平台，还是建议你先跟指导老师沟通好，按照指导老师的一键来进行查重

一篇论文在撰写完成后，无论是否需要发表，都是需要进行对论文原创的检测的，而现在检测原创度的方式就是进行论文查重检测。很多人想要知道英文论文查重原理是什么，是如何进行查重检测的。查重系统原理论文查重检测系统查重检测英文是需要确认的，有的查重系统是可以检测英文的，有的则是不可以检测英文的。要是可以查重检测英文，那查重系统的查重检测规则是连续十三个字符以上相似的话， 就定义为重复或抄袭的。中文和英文的区别是中文通常占两个字符，而英文中一个单词占一个字符，论文查重检测规则是适用于英文论文查重的，不但如此有的论文查重系统数据库中是涵盖有英文数据库的，要是数据库涵盖英文，论文查重检测系统对英文论文查重检测是完全没有问题的。字数查重要求英文论文查重检测的时候，不同的论文查重系统在查重检测时遵循的原理是不一样的。有的对单词有严格的要求，要求单词是不可以超过多少字数，否则的话就会被判定为抄袭的。而有的查重系统即便是标点符号一样的话也是会被算在字数中的，对于这样的论文查重系统查重检测出的论文查重率相对来说是会高一些的。期刊论文查重由于论文查重系统的提升和越来越智能，所以不止是涵盖中文的学术不端，也有搭建英语学术端，对国外期刊论文和硕博论文等是有进行收录的。所以论文查重系统对英文的查重检测是可进行字数对比的。换句话说，如果只是把论文查重系统收录的中文论文翻译成英文，或把收录的英文翻译成中文，这种情况基本上是不可以避免论文查重系统进行查重检测的。要知道论文查重系统依据组织的相似性和连续十三个字符重复算的原理，相同可对这类的论文进行查重检测的。对于英文论文撰写者来说，尽心撰写英文论文的时候，为了可以保证一个比较低的论文查重率的话，是需要尽可能的用自己的话术表达出中心思想的。

外语系毕业论文检测

可以检测英文，韩语、法语等各种语言及小语种

随着国家化进程的提高，不仅国家之间的交流越来越密切，日常生活之间的交流也逐渐国际化。英语作为一种国际语言，在交流中发挥着巨大的作用。因此，越来越多的高校开始要求毕业生撰写英语毕业论文，以锻炼学生的外语交际能力，英语毕业论文也需要检测。那么英语专业论文查重不超过多少？paperfree小编给大家讲解。 英语专业论文的查重率不超过30％，英语专业论文的查重率和普通论文的查重率一致，要求不超过30％。985/211一些优秀院校的英语专业要求查重率不高于20％。 目前，英语毕业论文的查重检测主要是通过高校内部查重系统进行的。近年来，论文查重系统的发展包含了大量的外国文献，英语毕业论文的查重检测原则是重复的英文论文首先是自动识别论文格式，主要是筛选出内容比较的内容，只有正确标注格式的内容才能正确识别。因此，有必要确保论文格式正确，这可以降低许多不必要的重复率。 论文查重的核心部分是文本内容查重检测。查重系统根据一个句子连续重复13个以上的字符来判断论文的重复或剽窃，引用的内容重复设置了5％的阈值。因此，对论文进行查重检测，对论文内容中的重复内容进行查重检测，并计算论文的查重率，因此，后期论文降重的要点也是连续重复13个字符。

偏低，但是也是合理的。一般来说，在这些文章中检测到的相似率是来自相对分散来源的匹配文本或常见短语。通常，每个匹配源的相似度仅占百分之一到百分之三，在期刊允许的合理范围内。这类重复检查的结果对识别论文是否抄袭的影响很小，几乎可以忽略不计。但是，也有可能只有一个部分的提取物所占比例特别大，因此至少需要确认一个来源的重复率高于百分之十，然后重写重复较多的部分。

论文检测中的跨语言检测

把中文论文翻译成英文会被查重的。

现在知网已经重新更新升级了，类似图片、翻译等都能被被查重，以前的大学生因为在写作能力欠缺，就会从知网上下载一些中文文章，然后用百度翻译或者有道翻译把文章从中文改成中文，或者找英语外国语专业的学生代为翻译，也可以请代写或者在淘宝上去买文章，避免查重。

以前确实查不出来，时代在进步，工具也在更新，所以不是原创的文章都有可能被查重。

文科类文章，可以用相近、类似的词语代替原有的意思，同时也可以将自己的观点，思想上完善、修改，但是整体的结构、脉络上还是有所相似，被查重的几率还是存在。

理科类的文章就比较困难，因为理工科的数据是通过实验分析、定量检测、模具分析等实验的结果来进行填补的，数据是不会人的，所以数值是不变的，翻译成英文，主心词汇还是那些，不过就是换了英文罢了，依旧会有被查重的可能。

论文的格式：

题目：应简洁、明确、有概括性，字数不宜超过20个字。

摘要：要有高度的概括力，语言精练、明确，中文摘要约100—200字。

关键词：从论文标题或正文中挑选3～5个最能表达主要内容的词作为关键词。

目录：写出目录，标明页码。

正文：论文正文字数一般应在1000字以上。主要说明论文写作的目的、现实意义、对所研究问题的认识，并提出论文的中心论点等。前言要写得简明扼要，篇幅不要太长。

以上内容参考：AEIC-论文的格式

不影响。跨语言检测结果一般都是0.学校一般都不看这个指标的。

硕博本科毕业论文，还是期刊职称论文。报告里面好多标注的指标都是一样的，其中一个指标“去除本人已发表文献复制比”在一定情况下特别重要。1、总文字复制比，就是这篇文章相似的总比例2、跨语言检测结果，就是从其他国家语言翻译成中文后的检测的相似比例。3、去除引用文献复制比，就是去掉这篇文章引用文献内容4、去除本人已发表文献复制比，是去除和自己发表文章重复的内容后的比例。5、单篇最大文字复制比，也就是字面意思，引用内容最多的部分相似比例。一般我们参考相似比例都是以“去除本人已发表文献复制比”和“总文字复制比”为主要参考指标，这两个数据指标怎么确定以哪个为准呢？这个要分成下面几种情况：1、没发表见刊的论文比如要新写一篇学术论文准备发表，投稿之前要自检一下，看看参考引用的内容比例是不是符合杂志社要求，还有就是一些没有引用自己发表文章的毕业论文，这时候要是用知网查重系统检测，这种情况下“总文字复制比”会和“去除本人已发表文献复制比”结果是一样的，以哪个为准都行。2、已经发表见刊的论文这种情况一般是论文已经发表，现在评职称要用，再检测这种论文时，会和自己已经发表的这篇文章重复

知网学术不端论文检测查重网 > 检测资讯 > 中国知网论文查重中关于“去除引用文献复制比”和“去除本人已发表文献复制比”析疑中国知网论文查重中关于“去除引用文献复制比”和“去除本人已发表文献复制比”析疑 检测资讯 admin 5年前 (2016-08-23) 61089次浏览初次使用中国知网学术不端查重系统，对“去除引用文献复制比”的百分比比较重视，对“去除本人已发表文献复制比”的百分比不太了解，甚至有点儿疑惑：cnki“去除引用文献复制比”很好理解，就是查论文中“去掉已经标明出处的文献”之后的重复率，“去除本人已发表文献”就应该是去除引用本人文献之后的重复率，本人文献也应该包括在前面的“去除引用文献复制比”之中，列出这两者意在何处？为何后者的百分比总是比前者的高？其实这个查重系统主要的目的是查出引用别人的文字但是却不愿意注明人家的名字，把别人的文字拿来当做自己的，将别人的据为己有，这就是抄袭，所以，所谓的查重，就是查抄没抄的问题。，既然“引用文献”和“本人文献”都是在查重“去除”之列，那就说明这些“引用文献”和“本人文献”都是注明出处的规范的行为这些是可以重复的，当然不能太多，但是标准却又难以量化。什么样的引用不算抄？就是引用别人的文字的时候注明出处，需要人家的东西的时候不是去偷偷拿来不敢声张，而是去借来。表现在文字上，偷偷拿多少文字过来算抄袭？一般的情况下，还是比较宽松的，“去除引用文献复制比”15%以下，可以勉强过关。但是，还是要说明的，如果一篇文章中在引用别人的文字时，倒也规规矩矩的注明出处了，太多的话，也不行，因为引用人家的太多，很容易就把别人的观点抄来了。就是说，如果你家里的东西全是明目张胆的去邻居家借来的，你能说这家里的东西都是你的吗？你只有使用权没有拥有权，占据这些东西的意义是什么呢？ 所以“去除引用文献复制比”，就是去除了“引用自己的文字且标明出处”和“引用他人的文字且标明出处”的，去除了这些规范的引用文字，如果还有重复比率，那就是包括了“引用自己的文章没有标明出处的”和“引用别人文字没有标明出处的”，这些都是不规范的行为，一旦比率高了，就是抄袭了。 其实，一篇原创的论文，在“去除引用文献复制比”后，重复比率应该为0的，但是因为现在天下文章一大抄的现象太严重了，所以各个科研部门在查重的时候也不得不水涨船高，这就是法难责众，在人们“违法”现象太普遍的情况下，只好一律从轻处理，重新设定标准了。“去除本人已发表文献复制比”后的重复率就包括了“引用他人文献注明出处的”，加上“用自己的已经发表过的文字但是没有注明出处的”，加上“用他人文字没标明出处的”，（重复自己已经发表的文字但是没有注明出处的也是不规范行为），这三类都是不规范的引用行为，比“去除引用文献复制比”后的重复率多了“引用他人文字有出处的”的规范的内容，即“去除本人已发表文献复制比”后的重复率中包括了引用他人文献的规范内容。所以查重结果如果有重复现象的话，“去除本人已发表文献复制比”后的重复率总是比“去除引用文献复制比”的重复率高一些。查“去除引用文献复制比”的重复率目的是为了查不规范的行为，“去除本人已发表文献复制比”的查重主要目的是为了看文章在引用自己的文献之外还有多少是规范引用别人的和不规范的抄袭。如果不规范的比率低，而所谓的注明出处的规范引用现象比较严重，也应该予以注意，加以改正 。举例：如果“去除引用文献复制比”的重复率是，那按照当前的标准来看，这样的文章不算是抄袭，应该算是不规范引用，把出处加上去就可以了。“去除本人已发表文献复制比”的重复率是43%，那么43%—。那这个就是引用他人文献有出处的重复率，就是属于规范的重复率。但是这个貌似规范的重复率也实在太高了，就是说引用太多了也有剽窃他人文字表述的嫌疑，因此如果采用这样的文章，就要要求作者不仅把不规范的引用处注明出处，还要把一些引用太多的文献进行精简和删除。由此可见，查“去除引用文献复制比”的重复率的主要目的是为了查出引用别人文字但是却尊重别人的知识产权的不规范行为，查出是否抄袭别人的观点和文字表述。就是说，“去除引用文献复制比”后的重复率中包括的全是不规范的引用行为，“去除本人已发表文献复制比”后的重复中包括了不规范的和规范引用的行为，所以，“去除引用文献复制比”的重复率是查抄袭最关键的一个数据，查重应该是因这个数据为主，而不是后者和总数据，目前有的单位看总比率据是有失偏颇的。还有一个单篇数字重复最高的数据统计，可以适当作为“规范引用”太多的情况的参考，不管是注明出处还是没注明出处的引用，即使是规范的引用自己的文献，重复字数太多也是不规范的，这就有可能是把自己已经发表过的大部分文字和观点拿出来再发一次，就可能造成事实上的一稿多投，重复劳动，即使再发表出新的文章但是因为重复自己的太多，也就没有创见了。

外观检测机论文

在淘宝网站上搜书名，认准了购买比较便宜。

对数控机床维修五步到位法的探索 [2010-10-07 02:22] [摘要]随着国内数控机床的迅速发展,数控机床逐步出现故障高发时段。然而,目前的数控维修工作混乱无序,根本不能适应数控行业快速发展的步伐。为了使数控维修工作适应现代化制造业的发展,提高数控设备维修质量,那么规范数控维修行业,已经迫在眉睫。本文通过阐述五步到位法,使其具有可利用性、可持续发展性,为规范数控维修行业奠定坚实的基础。 [关键词]数控维修 五步到位法 探索 一、前言 随着我国机械加工的快速发展,国内的数控机床也越来越多。由于数控机床的先进性和故障的不稳定性,大部分故障都是以综合故障形式出现,所以数控机床的维修难度较大,并且数控机床维修工作的不规范,使得数控维修工作处于一种混乱状态,为了规范数控维修工作,提高数控机床的利用价值,本文提出五步到位数控维修法。 二、五步到位法 1.故障记录到位 数控机床发生故障时,对于操作人员应首先停止机床,保护现场,并对故障进行尽可能详细的记录,并及时通知维修人员。 ⑴故障发生时的情况记录 1)发生故障的机床型号,采用的控制系统型号,系统的软件版本号。 2)故障的现象,发生故障的部位,以及发生故障时机床与控制系统的现象。 3)发生故障时系统所处的操作方式。 4)若故障在自动方式下发生,则应记录发生故障时的加工程序号,出现故障的程序段号,加工时采用的刀具号等。 5)若发生加工精度超差或轮廓误差过大等故障,应记录被加工工件号,并保留不合格工件。 6)在发生故障时,若系统有报警显示,则记录系统的报警显示情况与报警号。 7)记录发生故障时,各坐标轴的位置跟随误差的值。 8)记录发生故障时,各坐标轴的移动速度、移动方向,主轴转速、转向等。 ⑵故障发生的频繁程度记录 1)故障发生的时例与周期。 2)故障发生时的环境情况。 3)若为加工零件时发生的故障,则应记录加工同类工件时发生故障的概率情况。 4)检查故障是否与“进给速度”、“换刀方式”或是“螺纹切削”等特殊动作有关。 ⑶故障的规律性记录。 ⑷故障时的外界条件记录。 2.故障检查到位 维修人员故障维修前,应根据故障现象与故障记录,认真对照系统、机床使用说明书进行各顶检查以便确认故障的原因。当数控设备出现故障时,首先要搞清故障现象,向操作人员了解第一次出现故障时的情况,在可能的情况下观察故障发生的过程,观察故障是在什么情况下发生的,怎么发生的,引起怎样的后果。搞清了故障现象,然后根据机床和数控系统的工作原理,就可以很快地确诊并将故障排除,使设备恢复正常使用。故障检查包括: ⑴机床的工作状况检查。 ⑵机床运转情况检查。 ⑶机床和系统之间连接情况检查。 ⑷CNC装置的外观检查。 维修时应记录检查的原始数据、状态,记录越详细,维修就越方便,用户最好编制一份故障维修记录表,在系统出现故障时,操作者可以根据表的要求及时填入各种原始材料,供维修时参考。3. 诊断故障到位 故障诊断是进行数控机床维修的第二步,故障诊断是否到位,直接影响着排除故障的快慢,同时也起到预防故障的发生与扩大的作用。首先维修人员应遵循以下两条原则: (1)充分调查故障现场。这是维修人员取得维修第一手材料的一个重要手段。 (2)认真分析故障的原因。分析故障时,维修人员不应局限于 CNC部分,而是要对机床强电、机械、液压、气动等方面都作详细的检查,并进行综合判断,达到确珍和最终排除故障的目的。 1)直观法。2)系统自诊断法。3)参数检查法。4)功能程序测试法。5)部件交换法。6)测量比较法。7)原理分析法。8)敲击法。9)局部升温法。10)转移法。 除了以上介绍的故障检测方法外,还有插拔法、电压拉偏法、敲击法等等,这些检查方法各有特点,维修人员可以根据不同的现象对故障进行综合分析,缩小故障范围,排除故障。 4.维修方法到位 在数控机床维修中,维修方法的选择到位不到位直接影响着机床维修的质量,在维修过程中经常使用的维修方法有以下几种: (1)初始化复位法。由于瞬时故障引起的系统报警,可用硬件复位或开关系统电源依次来清除故障,若系统工作存贮区由于掉电、拔插线路板或电池欠压造成混乱,则必须对系统进行初始化清除,清除前应注意作好数据拷贝记录,若初始化后故障仍无法排除,则进行硬件诊断。 (2)参数更改,程序更正法。系统参数是确定系统功能的依据,参数设定错误就可能造成系统的故障或某功能无效。有时由于用户程序错误亦可造成故障停机,对此可以采用系统搜索功能进行检查,改正所有错误,以确保其正常运行。 (3)调节、最佳化调整法。调节是一种最简单易行的办法。通过对电位计的调节,修正系统故障。 (4)备件替换法。用好的备件替换诊断出坏的线路板,并做相应的初始化启动,使机床迅速投入正常运转,然后将坏板修理或返修,这是目前最常用的排故办法。 (5)改善电源质量法。目前一般采用稳压电源,来改善电源波动。对于高频干扰可以采用电容滤波法,通过这些预防性措施来减少电源板的故障。 (6)维修信息跟踪法。一些大的制造公司根据实际工作中由于设计缺陷造成的偶然故障,不断修改和完善系统软件或硬件。这些修改以维修信息的形式不断提供给维修人员 (7)修复法。对数控机床的故障进行恢复性修复、调整、复位行程开关、修复脱焊、断线、修复机械故障等。 5.维修记录到位 维修时应记录、检查的原始数据、状态较多,记录越详细,维修就越方便,用户最好根据本厂的实际清况,编制一份故障维修记录表,在系统出现故障时,操作者可以根据表的要求及时填入各种原始材料,供再维修时参考。 通常维修记录包括以下几方面的内容;(1)现场记录;(2)故障原因;(3)解决方法;(4)遗留的问题;(5)日期和停工的时间;(6)维修人员情况;(7)资料记录。 三、结束语 五步到位法的实施,提高重复性故障的维修速度,提高维修者的理论水平和维修能力,有利于分析设备的故障率及可维修性,改进操作规程,提高机床寿命和利用率,并能充分实现资源共享。使其具有可利用性、可持续发展性,为规范数控维修行业奠定坚实的基础。 参考文献: [1]沈兵,历承兆.数控系统诊断与维修手册.北京机械工业出版社, 2009. [2]杨中力.数控机床故障诊断与维修.天津:天津理工大学出版社, 2008. [3]孙伟.数控设备故障诊断与维修技术.北京国防工业出版社, 2008.

汽车检测论文

汽车检测是指为了确定汽车技术状况是否达到标准或工作能力是否正常而进行的检查和测量。下面是我为大家精心推荐的汽车检测技术论文，希望能够对您有所帮助。

国内汽车检测技术概况

[摘 要] 本文通过了解我国国内汽车检测技术的概念及其分类，介绍了我国一些先进前沿的汽车检测技术，阐述了我国汽车检测技术的发展概况，针对我国汽车检测技术中的不足之处，结合我国汽车检测技术的具体发展形势，提出了我国汽车检测技术的发展方向，这对我国汽车检测技术的发展具有一定的现实指导意义。

[关键词] 汽车检测;检测技术;国内现状;发展概况

1.汽车检测的概念

汽车检测是指为了确定汽车技术状况是否达到标准或工作能力是否正常而进行的检查和测量。汽车检测技术则是指在汽车检测这一过程中所有与之相关的检测硬件和检测软件的研发和使用技术。

2.汽车检测技术的分类

安全环保检测

安全环保检测主要是针对汽车的安全运行和环境保护方面的检测，这种检测又分为定期检测和不定期检测。该检测的目的是为了确定车辆是否具备符合要求的外观容貌以及良好的安全性能，同时对汽车的环境污染程度进行有效控制。在汽车不解体的情况下，对汽车建立安全监控体系，确保汽车能高效、安全和低污染的运行。

综合性能检测

综合性能检测是指对汽车的综合性能实行定期或者不定期的'检测。该检测的目的是为了确定汽车是否具有良好的动力性、可靠性、安全性、噪声污染性以及排气净化性。该检测主要针对汽车的故障及其原因或隐患部位实行质量监督和检测，从而建立汽车质量监控体系，来达到该检测技术的目的。

3.国内汽车检测技术的发展情况

国内汽车检测技术的发展历程

(1)20世纪60年代，我国汽车检测技术处于起步阶段。我国开始研究汽车检测技术开始于20世纪60年代，为了满足当时的汽车维修需要，我国交通部门研究和开发了发动机汽缸漏气量检测仪以及点火正时灯等一些基本的检测仪器。

(2)20世纪70年代，我国汽车检测技术进入发力发展阶段。随着我国汽车生产技术以及人们汽车使用率的飞速增长，我国交通部门开始进入大力发展汽车检测技术的阶段。汽车检测的仪器设备增多，检测项目增多，检测标准和规则也得到进一步的完善，建立了汽车性能综合检验台。

(3)20世纪80年代，我国汽车检测技术进入快速发展阶段。随着我国科学技术和国民经济的飞速发展，我国汽车制造业和交通运输业也得到了飞速发展。因此，对汽车检测技术和设备的需求也日益增涨。我国汽车检测技术因此进入其发展的蓬勃向上时期。

(4)20世纪90年代至今，我国汽车检测技术已经发展相对成熟。迈入90年代后，我国汽车检测技术从其设备的研制、开发以及生产都有了自身的一套运作体系。90年代是我国汽车检测技术的发展高潮时期。虽然目前我国的汽车检测技术与外国仍存在一定的差距，其发展的过程中也存在有一些问题和不足，但我国汽车检测技术也在不断的吸收借鉴完善自己，保证自身良好的发展态势，努力为其创造广阔的发展前景。

目前国内具有代表性的先进前沿的汽车检测技术

(1)虚拟仪器检测技术

虚拟仪器检测技术是指通过自由增减测试系统配置，利用系统配置单元器件，按照每一个项目测试的要求标准，可以直观和有效的得出监测结果，从而提高测试技术的效率。

(2)将GPS技术与车辆检测相结合

该技术主要是利用了能够接受卫星定位信号的GPS系统，将其与汽车检测技术系统相结合，从而达到快捷有效的检测过程。

(3)利用汽车四轮定位进行检测

四轮定位仪主要是依据车轮定位得到检测数据，它利用图像显示并记录汽车四轮的运作情况，与汽车检测数据结果分析相结合，从而达到检测目的。

4.国内汽车检测技术发展过程中存在的问题

国内汽车检测站的经营管理过程中存在行政干预问题

在我国，安全检测是由公安部门来建立管理的。因此我国的综合性能检测站都由交通部门直接建立并管理或者由地方企业建立但仍由交通部门管理。这种行政管理形式，往往造成了检测结果的不真实、检测过程的不规范或者检测项目不完善的情况，甚至是伪造一些监测数据。

我国汽车检测存在重复检测的问题

目前，我国有权对汽车进行检测的机构至少有三种，即安检站、机动车尾气排放检测站以及汽车综合性能检测站。这三个机构又分别归隶属于公安、环保、和交通管理部门。这些部门从各自的职能要求出发对车辆进行必要的检查和监测，容易造成车辆的重复检查，在加大汽车检测工作量的同时，给车主也带来不便。

检测技术有待进一步完善

目前，我国的进口汽车检测标准体系主要依赖于外国检测标准，因此针对我国汽车具体发展情况，我国的汽车检测技术有待进一步提高和完善。例如，我国目前的技术可以对车辆的正面、侧面、追尾等事故进行检测，但对侧面碰撞、追尾碰撞等事故却缺乏相关的检测标准。这也急需我国汽车检测技术的提高和完善。

我国汽车检测人员的整体专业能力和专业素质有待提高

一方面，我国的汽车检测人员的专业检测能力有待提高。一些检测人员本身缺乏基本的汽车知识，检测操作不规范，对检测结果的分析能力不够，不能很好的判断汽车是否达到检测标准。另一方面，我国汽车检测人员的自身素质不够，一些检测人员故意抬高检测收费标准，为了个人利益不顾集体利益，甚至为一些没有达到标准的车辆伪造数据。这些都是造成安全隐患的个人因素，也不利于我国检测技术的研发和推广。

5.解决国内汽车检测技术发展过程中的问题的有效措施

汽车检测技术基础实现规范化

在我国汽车检测技术的发展过程中，汽车检测的硬件技术一直以来都比汽车检测技术中的软件技术更受重视。这种想法往往会导致对一些基础性技术研究的忽略。因此，我国汽车检测技术的发展方向应该注重与硬件配套的软件检测技术的完善和提高。这方面主要做到三点：一，制定并完善汽车检测项目的限值标准和检测方法;二，完善汽车技术状况检测的评定细则，将全国各地的检测要求和具体操作技术进行统一和规范化;三，严格执行综合性能检测站对大型检测设备的认证规则，确保综合性能检测站有能力胜任并履行其检测职责。

汽车检测设备实现智能化

虽然目前我国的汽车检测技术以及检测设备的智能化与国外的检测存在一定的差距，但是我国汽车检测设备正积极学习并通过进口一些外国先进检测设备来提高并完善我国汽车检测设备的智能化。检测设备的智能化使检测设备具有专家检测和诊断系统以及智能化的功能，可以在较短时间较快较准确的对汽车状况进行检测，并诊断出汽车发生故障的部位以及故障原因，从而让维修人员能够迅速解除故障。节约了劳动成本，提高了劳动效率。

汽车检测管理实现网络化

随着计算机和网络技术的飞速发展，我国各个行业都在逐步实现其管理的网络化，汽车检测行业也不例外。目前，虽然我国的部分汽车综合性能检测站已经实现了计算机管理系统检测，但计算机监控系统并不完善，而且各个检测站之间采用的计算机检测方式也都一致。为了逐步实现我国汽车检测管理的一致性和有效性，我国汽车检测应该积极推进其管理的网络化。

6.总结

随着我国经济和社会的进步以及汽车工业的发展，我国汽车检测技术也必须不断的提高和完善。为了使汽车维修人员的工作越来越轻松，提高汽车检测结果准确性，我国汽车检测技术的发展越来越趋向于自动化、网络化和智能化。汽车检测技术的完善和提高有利于我国交通事业以及环保事业的发展，从而为我国经济和社会的发展提供良好的外在环境。

参考文献

[1] 初君浩;浅析汽车检测技术的发展[J];科技致富向导;2014(08)25.

[2] 王洪亮;汽车检测技术的若干问题的思考[J];无线互联科技;2013(12)15.

作者简介

张彦(1975-)女，汉族，山东菏泽人，助理工程师，大学学历，毕业于山东省委党校经济管理专业，研究方向为车辆检测、维修。

pcr检测国外论文

:张立国、石建党、冯剑利、李钟、张琚. Type IV collagenase (matrix metalloproteinase-2 and-9) in prostate cancer. PROSTATE CANCER AND PROSTATIC DISEASES 吴荃，周颖，陈林峰，石建党，王春雨，苗琳，Mocker, H; Park, I;李钟，张琚. Benign prostatic hyperplasia (BPH) epithelial cell line BPH-1 induces aromatase expression in prostatic stromal cells via prostaglandin E2. JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY王春雨，石建党，闫春和，吴荃，Klocker, H; Park, I;李钟，张琚. Development of a cell-isolation method for human prostatic smooth muscle cells based on cell type-specific activation of the SM22 gene promoter. BJU INTERNATIONALZhang, J; Qi, HX; Wang, HJ; Hu, P; Ou, LL; Guo, SH; Li, J; Che, YZ;Yu,YT; Kong, DL. Engineering of vascular grafts with genetically modified bone marrow mesenchymal stem cells on poly (propylene carbonate) graft. ARTIFICIAL ORGANS张智松王亮梅玫朱彦杜小玲李钟Irwin Park张琚石建党. Both nongenomic and genomic effects are involved in estradiol’s enhancing the phenotype of smooth muscle cells in cultured prostate stromal cells. The Prostate樊官伟高秀梅王宏朱彦张琚胡黎明Yan-Fang Su, Li-Yuan Kang,张伯礼. The anti-inflammatory activities of Tanshinone IIA, an active component of TCM, are mediated by estr. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology周颖肖向茜陈林锋杨睿石建党杜小玲Helmut Klocker, Irwin Park李钟张琚. Proliferation and phenotypic changes of stromal cells in response to varying estrogen/androgen levels in castrated rats. Asian Journal of AndrologyIrwin I Park, Qiang Zhang, Victoria Liu,张琚, Chung Lee. Estrogen at low concentrations acts through distinct pathways in normal versus BPH-derived prostate stromal cells. the Journal of Clinical Endocrinology张立国王春雨杨睿石建党符蓉陈林锋Helmut Klocker张琚. Real-time quantitative RT-PCR assay of prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in peripheral blood for detection of prostate cancer micrometastasis. Urol Oncol张智松段磊杜小玲马洪顺Irwin Park李钟张琚石建党. The proliferative effect of estradiol on human prostate stromal cells is mediated through activation of ERK. The Prostate吴荃石建党陈林锋王春雨Irwin Park李钟张琚. Regulation of proliferation and differentiation of prostatic stromal cells by estradiol through prostateic epithelial cells (BPH-1) in a paracrine manner. The BJU International刘树业Yu XD, Song CJ, Lu W, Zhang JD, Shi XR, Duan Y张琚. Cloning and expression of special F protein from human liver. World Journal of Gastroenterology牛远杰马腾骧张琚徐勇韩瑞发孙光. Androgen and prostatic stroma. ChinaAsian J AndrolZhou W, Park I, Pins M, Kozlowski JM, Jovanovic B,张琚,李钟, Ilio K. Dual regulation of proliferation and growth arrest in prostatic stromal cells by transforming growth factor-beta1. Endocrinology张琚Klaus Jung, Michael Lein, Glen Kristiansen, Birgit Rudolph, Steffen Hauptmann, Dietmar Schnorr, Stefan A. Loening, and Ralf Lichtenhagen. Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human primary cultured prostatic cells and malignant prostate cell lines. The Prostate牛远杰徐勇张琚马腾骧. Proliferation and differentiation of prostatic stromal cells. BJU InternationalSimone T. Boesch, Stefan Corvin,张琚, Hermann Rogatsch, George Bartsch, and Helmut Klocker. Modulation of the Differentiation Status of Cultured Prostatic Smooth Muscle Cells by an a1-Adrenergic Receptor Antagonist. The ProstateFibroblast Growth Factor Levels in Cancer Cell and in Sera of Patients suffering from Proliferative Disorders of the Prostate. The Prostate 张琚, Michael W. Hess, Martin Thurnher, Alfred Hobisch, Christian Radmayr, Marcus V. Cronauer, Anton Hittmair, Zoran Culig, Georg Bartsch and Helmut Klocker. Human prostatic smooth muscle Cell in culture: Estradiol enhances expression of smooth muscle cell-specific markers. The prostateZoran culig, Alfred hobisch, Marcus V. Cronauer, Christian Radmayr, Anton Hittmair,张琚, Martin Thurnher, Georg Bartsch and Helmut Klocker. Regulation of prostatic growth and function by peptide growth factors. The prostateMathias ziegler, Dierk Jorcke,张琚, Rainer Schneider, Helmut Klocker, Bernhard Auer, Manfred Schweiger. Characterization of Detergent-Solubilized Beef Liver Mitochodrial NAD?glycohydrolase and its Truncated Hydrosoluble Form. Biochemistry 张琚, Mathias Ziegler, Rainer Schneider, Helmut Klocker, Bernhard Auer, Manfred Schweiger. identification and purification of a bovine liver mitochondrial NAD?glycohydrolase. FEBS LETTERS杨睿，张立国，符蓉，王春雨，刘树业，石建党，张琚. 实时定量PCR技术检测前列腺癌微小转移的研究. 南开大学学报于林，王春雨，杨睿，王亮，石建党*，张琚. TAT-GFP-ERB融合蛋白的原核表达与鉴定. 南开大学学报周颖,杨睿,石建党*,刘杰,杜小玲,王克明,张琚*. BPH间质细胞增殖和表型转化与雌激素受体α表达的关系. 解剖学报苗琳,石建党*,周颖,杜小玲,吴荃,王克明,张琚*. BPH-1通过分泌PGE2上调前列腺间质细胞ERR?的表达. 中国生物化学与分子生物学报张智松,刘杰,杜小玲,段磊,张琚*,石建党. 雌激素快速激活MAPK途径促进前列腺间质细胞的增殖. 中国生物化学与分子生物学报Rui Yang, Yu-Xia Ma, Lin-Feng Chen, Ying Zhou1, Zhan-Po Yang, Yan Zhu, Xiao-Ling Du, Jian-Dang Shi*, Hong-Shun Ma, Ju Zhang*. Antagonism of estrogen-mediated cell proliferation by raloxifene in prevention of ageing-related prostatic hyperplasia. Asian Journal of Andrology苗琳;周颖;石建党;杜小玲;焦鸿丽;张琚. 雌二醇通过TGFβ1促进前列腺间质细胞MMP-2的表达. 中国生物化学与分子生物学报 Miao, Jiandang Shi , Chun-Yu Wang, Yan Zhu, Xiaoling Du, Hongli Jiao, Zengnan Mo, Helmut Klocker, Chung Lee, . Estrogen receptor-related receptor alpha mediates up-regulation of aromatase expression by prostaglandin E2 in prostate stromal cells. Mol EndocrinolRui Yang, Da Xu, Jiandang Shi*, Helmut Klocker, Chung Lee, Ju Zhang*. Tanshinone IIA inhibits estrogen/androgen induced prostatic stromal hyperplasia. The Journal of Urology Yu, Jiandang Shi, Chun Yu Wang, Helmut klocker, Doris Mayer*, Ju Zhang*. Estradiol promotes the invasive potency of prostate cancer cells in a paracrine manner through stimulation of prostatic stromal cells. The Journal of Urology . Zhang, L. Wang, . Ma, . Du, J. Zhang*, . Shi* . nongenomic and genomic effects are involved in estradiol’s enhancing the phenotype of smooth muscle cells in cultured prostate stromal cells(AUA). The Journal of Urology . Zhou, . Xiao, R. 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Estrogens Promote Invasion of Prostate Cancer Cells in a Paracrine Manner through Up-Regulation of Matrix Metalloproteinase 2 in Prostatic Stromal Cells. EndocrinologyLinjian Mo, Ju Zhang, Jiandang Shi, Qiang Xuan, Xiaoli Yang, Min Qin,Chung Lee, Helmut Klocker, Qingdi Quentin Li and Zengnan Mo. Human Kallikrein 7 Induces Epithelial?Mesenchymal Transition-like Changes in Prostate Carcinoma Cell. Anticancer Cui , ZhongLian Li , ErPeng Zhao , YanFeng Jia , DongHua Li , Ju Zhang and NaiQiang Cui. Overexpression of Sterol Carrier Protein 2 in Patients with Hereditary Cholesterol Gallstones. BMC Gastroenterology 彭雁飞，师莹，王亮，石建党*，杨小丽，张琚*. 用腺病毒载体包装不同分化程度平滑肌细胞特异性启动子的策略分离鉴定人前列腺间质细胞亚群. 南开大学学报Lin Yu, Jiandang Shi, Sa Cheng, Yan Zhu, Xiulan Zhao, Kuo Yang, Xiaoling Du,Helmut klocker，Xiaoli Yang，Ju Zhang*. Estrogen promotes prostate cancer cell migration via paracrine release of ENO1 from stromal cells. Molecular Endocrinology杜小玲，宁召臣，王春雨，石建党，张琚*. 类固醇激素受体辅助调节因子ARA55和TGFβ1在前列腺癌细胞中作用分子机制的研究. 南开大学学报（自然科学版）Lin Miao, Sina Grebhardt, Jiandang Shi, Isabelle Peipe, Ju Zhang, Doris Mayer. Prostaglandin E2 stimulates S100A8 expression by activating protein kinaseA and CCAAT/enhancer-binding-protein-beta in prostate cancer cells . The International Journal of Biochemistry & Cell Biology --1

I THINK IT IS GOOD. AND IT IS BETTER. PCR技术王霄鹏 推荐：栗瑞丰摘要：PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作1. PCR的基本原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。2. PCR的基本成分PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。PCR的基本操作PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。1. 基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：l 扩增目的基因和鉴定重组子；l 克隆基因；l 基因功能和表达调控的研究；l 基因组测序；l 制备单链模板；l 致突变；2. PCR在临床上的应用l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。l 检测病原体l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3. 在法医学中的应用例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年

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Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateby Escherichia coli transformant cells coexpressingthe carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞合成纯光学（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate((S)-CHBE) was investigated. Escherichia coli cells expressing both the carbonyl reductase (S1) gene from Candida magnoliae and the glucose dehydrogenase (GDH) gene from Bacillus megaterium were used as thecatalyst. In an organic-solvent-water two-phase system,(S)-CHBE formed in the organic phase amounted to M (430 g/l), the molar yield being 85%. E. coli transformant cells coproducing S1 and GDH accumulated M (208 g/l) (S)-CHBE in an aqueous monophase system by continuously feeding on COBE, which is unstable in an aqueous solution. In this case, the calculated turnover of NADP+ (the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) to CHBE was 21,600 mol/mol. The optical purity of the (S)-CHBE formed was 100% enantiomeric excess in both systems. The aqueous system used for the reduction reaction involving E. coli HB101 cells carrying a plasmid containing the S1 and GDH genes as a catalyst is simple. Furthermore, the system does not require the addition of commercially available GDH or an organic solvent. Therefore this system is highly advantageous for the practical synthesis of optically pure (S)-CHBE.本本篇文献研究了利用COBE不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。大肠杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属magnoliae的碳酰还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到（430g/l），摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了（208g/l），COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当的从NADP+到CHBE的转变达到了21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。Optically active 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid esters are useful chiral building blocks for the synthesis of pharmaceuticals. The (R)-enantiomer is a precursor of L-carnitine (Zhou et al. 1983), and (S)-enantiomer is an important starting material for hydroxymethylglutaryl- CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors (Karanewsky et al. 1990). Many studies have described the microbial or enzymatic asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoic acid esters (Aragozzini and Valenti 1992; Bare et ; Hallinan et al. 1995; Patel et al. 1992; Shimizu et al. 1990; Wong et al. 1985) based on the reduction by baker’s yeast (Zhou et al. 1983).We have previously showed that Candida magnoliae AKU4643 cells reduced ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to (S)-CHBE with an optical purity of 96% enantiomeric excess (.) (Yasohara et al. 1999). As this yeast has at least three different stereoselective reductases (Wada et al. 1998, 1999a, b), the (S)-CHBE produced by this yeast was not optically pure. From among these three enzymes, an NADPH-dependent carbonyl reductase, designated as S1, was purified and characterized in some detail (Wada et al. 1998). We cloned and sequenced the gene encoding S1 and overexpressed it in Escherichia coli cells. This E. coli transformant reduced COBE to optically pure (S)-CHBE in the presence of glucose, NADP+, and commercially available glucose dehydrogenase (GDH) as a cofactor generator (Yasoharaet al. 2000). Here, we describe the construction of three E. coli transformants coexpressing the S1 from C. magnoliae and GDH from Bacillus megaterium genes and analyze the reduction of COBE catalyzed by these strains. Previous reports on the enzymatic reduction of COBE to (R)-CHBE with an optical purity of 92% . (Kataoka et al. 1999; Shimizu et al. 1990) recommended an organic- solvent two-phase system reaction for an enzymatic or microbial reduction, because the substrate (COBE) is unstable in an aqueous solvent and inactivates enzymes. We examined the reduction of COBE to optically pure (S)-CHBE by E. coli transformants in a water monophase system reaction and discuss the possible use of this type of reaction system in industrial applications。具有旋光性的（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道利用来自念珠菌属magnoliae AKU4643 细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化COBE生成纯光学的CHBE。我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽孢杆菌的GDH，并分析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物（COBE）在水相中不稳定，并且酶容易钝化，所以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。Materials and methodsBacterial strain and plasmids The E. coli strains used in this study were JM109 and pGDA2, in which the GDH gene from B. megaterium is inserted into pKK223-3, was kindly provided by Professor I. Urabe, Osaka University (Makino et al. 1989). Plasmids pSL301 and pTrc99A were purchased from Invitrogen (USA), and Amersham Pharmacia Biotech (UK), respectively. Plasmids pUC19 and pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995) were purchased from Takara Shuzo (Japan).材料和方法菌株和质粒本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提供。质粒pSL301和 pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。The recombinant plasmid used in this study was constructed as follows (Fig. 1): Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kilobase pairs (kb) including the GDH gene. This fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSL301 to construct plasmid pSLG. Plasmid pSLG was double-digested with EcoRI and XhoI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene.这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2 被EcoRI 和 PstI双酶切从而分离出一个大小约为的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒Psl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。质粒pSLG被EcoRI和XhoI To construct plasmid pNTS1G, this fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of pNTS1, which was constructed to overproduce S1 as described previously (Yasohara et al. 2000). To construct plasmid pNTGS1, plasmid pNTG was first generated. Two synthetic primers (primer 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG,and primer 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) were prepared for polymerase chain reaction (PCR) using pGDA2 as the template. The PCR-generated fragment was double- digested with NdeI and EcoRI and then inserted into the NdeI EcoRI site of plasmid pUCNT, which was constructed from pUC19 and pTrc99A, as reported (Nanba et al. 1999), to obtain pNTG. To construct plasmid pNTGS1, two synthetic primers (primer 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and primer 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) were prepared using pUCHE, which contains the S1 gene as the template. The PCR-generated fragment was double-digested with EcoRI and SalI and then inserted into the EcoRI-SalI site of pNTG to obtain pNTGS1. Plasmid pNTS1G, pNTGS1 or pNTG was transformed into E. coli HB101.构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个大小的片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。两个合成引物（引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT）和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到的片段是由NdeI 和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到pNTG。根据报道，pUCNT是由pUC19和 pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)，包括了S1基因作为模板。Pcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到pntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1.质粒pNTS1G, pNTGS1或者 pNTG都是导入大肠杆菌 pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene. To construct plasmid pSTVG, this fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28. Plasmid pSTVG was transformed into E. coli HB101. 质粒pGDA2被EcoRI 和 PstI双酶切得到包含GDH基因的大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。Medium and cultivationThe 2×YT medium comprised Bacto-tryptone, yeastextract, and NaCl, pH . E. coli HB 101 carrying pNTS1,pNTG, pNTS1G, or pNTGS1 was inoculated into a test tube containing2 ml 2×YT medium supplemented with mg/ml ampicillin,followed by incubation at 37 °C for 15 h with reciprocal preculture ( ml) was transferred to a 500-ml shakingflask containing 100 ml 2×YT medium. The cells were cultivatedat 37 °C for 13 h with reciprocal shaking. E. coli HB101 carryingpNTS1 and pSTVG was similarly cultivated in 2×YT mediumsupplemented with mg/ml ampicillin and mg/ml chloramphenicol.培养基和培菌2*YT培养基 包含有细菌用胰蛋白胨，酵母提取物， NaCl，.携带有pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有氨苄青霉素的2ml的2*YT培养基，37°C摇床15小时。将菌液接种到100ml2*YT培养基的500ml烧瓶中。在37°C摇床培养13小时。携带有pNTS1 和 pSTVG质粒的大肠杆菌HB101在2*YT培养基中培养方法相似，只是培养基中要加入 mg/ml的氨苄青霉素和 mg/ml的氯霉素。Preparation of cell-free extracts and the enzyme assay Cells were harvested from 100 ml of culture broth by centrifugation, suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), and then disrupted by ultrasonication. The cell debris was removed by centrifugation; the supernatant was recovered as the cell-free extract. Carbonyl reductase S1 activity (COBE-reducing activity) was determined spectrophotometically as follows: The assay mixture consisted of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), mM NADPH, and 1 mM COBE. The reactions were incubated at 30 °C and monitored for the decrease in absorbance at 340 nm. The assay mixture for GDH activity consisted of 1 M Tris-HCl buffer (pH ), 100 mM glucose, and 2 mM NADP+. The reactions were incubated at 25 °C and monitored for the increase in absorbance at 340 nm. One unit of S1 or GDH was defined as the amount catalyzing the reduction of 1 μmol NADP+ or oxidation of 1 μmol NADPH per minute, respectively. Protein concentrations were measured with a proteinassay kit containing Coomassie brilliant blue (Nacalai Tesque, Japan),using bovine serum albumin as the standard (Bradford 1976).无细胞抽提液和酶鉴定将100ml培养液离心收获菌体，用为的磷酸缓冲液悬浮，然后超声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：的磷酸二氢钾缓冲液，和1mMCOBE。反应在30°C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸光值。测GDH混合物包括：1M pH 的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的NADP+。反应在25°C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义为每分钟催化还原1μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。Study of enzyme stabilityOne milliliter of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ) containing the cell-free extracts of E. coli HB101 carrying pNTS1 (S1: 20 U/ml) was mixed with an equal volume of each test organic solvent in a closed vessel. After the mixture was shaken at 30 °C for 48 h, the remaining enzyme activities in an aqueous phase were assayed as described above. The mixture, containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), S1 (20 U/ml), and various concentrations of CHBE, was incubated at 30 °C for 24 h in order to study the enzyme’s stability in the presence of remaining enzyme activities were assayed as described above.酶稳定性的研究一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓冲液（）与等体积的有机溶剂混合。混合物在30 °C震摇48小时后，水相中残留的酶活力即是上述的酶活力。COBE reduction with E. coli cells expressing the S1 gene and E. coli cells expressing GDH genes in a two-phase system reaction The reaction mixture comprised 15 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG, 17 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTS1, mg NADP+, 4 g glucose, g COBE, 25 ml n-butyl acetate, and about 25 mg Triton X-100. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. At 2 h, g COBE and g glucose were added to the reaction mixture. To compare the reaction by E. coli transformant coexpressing the GDH and S1 genes, 30 ml culture broth of E. coliHB101 carrying pNTS1G was used instead of culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG and E. coli HB101 carrying pNTS1. Other components and the procedure were the same as described above.表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的菌液17ml， mg NADP+，4 g葡萄糖，的COBE，25ml的n-butyl acetate丁酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制在。在反应两小时后，加入和葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转化细胞共表达GDH和S1基因，携带有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。 COBE reduction to (S)-CHBE in a two-phase system reaction The reaction mixture contained 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, 10 g COBE, 50 ml n-butyl acetate, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C, and the pH was controlled at with 5 M sodium hydroxide. Five grams of COBE/ g glucose and 10 g COBE/11 g glucose were added to the reaction mixture at 3 h and 7 h, respectively; mg NADP+ was added at 26 在两相系统中还原生成（S）-CHBE反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，葡萄糖，10gCOBE，50ml丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.在30°C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在。在第3小时加入5gCOBE和葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加入。 COBE reduction to (S)-CHBE in an aqueous system reaction The reaction mixture was made up of 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C. Fifteen grams of COBE was fed continuously by means of a micro-feeding machine at a rate of about g/min for about 12 h. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. The reaction mixture was extracted with 100 ml ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo. COBE在水相中还原成(S)-CHBE的反应反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，，11g葡萄糖和大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30°C15mg的COBE通过微量添加机器以 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH控制在。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱水。Analysis The organic layer was obtained on centrifugation of the reaction mixture and was assayed for CHBE and COBE by gas chromatography. Optical purity of CHBE was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as described previously (Yasohara et al. 1999).Enzymes and chemicals Restriction enzymes and DNA polymerase were purchased fromTakara Shuzo (Japan). COBE (molecular weight: ) was purchasedfrom Tokyo Kasei Kogyo (Japan). Racemic CHBE (molecularweight: ) was synthesized by reduction of COBE withNaBH4. All other chemicals used were of analytical grade andcommercially available.分析离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBE。COBE的光学纯度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。酶和化学试剂限制性内切酶和DNA聚合酶由takara公司购得，COBE（分子量：）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE（分子量）通过COBE及NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。Construction of E. coli transformants overproducing S1 and GDHTo express the carbonyl reductase S1 and GDH genes in the same E. coli cells, four expression vectors were constructed (Fig. 1). Plasmids pNTS1G and pNTGS1 contain the S1 gene from C. magnoliae, the GDH gene from B. megaterium, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. Plasmid pNTS1 contains the S1 gene, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. The enzyme activities in cell-free extracts of the E. coli transformants are shown in Table 1. E. coli HB101 cells carrying the vector plasmid pUCNT had no detectable S1 or GDH activity. E. coli HB101 carrying either pNTS1G or pNTGS1 showed S1 and GDH activity without isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. The S1 activities of these two transformants were lower than the GDH activities. To obtain a transformant whose S1 activity was equal to or greater than the level of GDH activity, we used a lower copy vector, pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995), to express the GDH gene. It may be possible to raise the S1 activity by lowering the GDH activity. Plasmid pSTVG contains the GDH gene, the lac promoter, the chloramphenicol resistance gene, and the replicative origin derived from pACYC184 for compatibility with the plasmid pNTS1. In E. coli HB101 carrying pNTS1 and pSTVG, the S1 activity was higher than the GDH activity, but this GDHlevel may be too low to regenerate in a COBE reduction reaction as described below.过产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建为了在同一大肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。质粒pNTS1G 和 pNTGS1包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH活性。携带有pNTS1G 或 pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了得到S1活性等于或者大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体pSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能会太低而在COBE还原反应中不能再生。 太长了，字数有限制，所以不能发完。分数我无所谓啦，我很少登录的。这应该算是基因工程的吧，是我以前自己翻的，不是很好。如果你要的话可以联系我的邮箱。