国外毕业论文怎么检测

国外毕业论文怎么检测

中文论文检测主要是以知网为主，绝大多数高校和期刊报社都是使用知网论文查重系统，知网的中文数据库容量十分大，几乎包括一切中文学术期刊的文献资料，因此能够满足很多种类型论文的检测查重要求。并且随着知网的发展更新，如今数据库中也以及收录了很多的英文资源数据，所以也是能够检测英语论文并且其重复率结果准确度较高，具有较高的参考价值，很多外国语学校已经与知网开展了合作关系。Turnitin是国际上使用范围最大的英文论文查重系统，收录有超级多并且全面的英语文献资源，而且还能够检测很多小语种论文，在英语论文查重领域是十分权威的，能够得出精准度很高的英语论文重复率结果。因此大家查重英语论文也可以使用Turnitin论文查重系统。

英语专业几乎每个大学都有一些专业。这些专业的学生毕业后必须提交英语毕业论文。我们还需要检测我们的论文。那么英语论文是如何检测和收费的呢？ 学校内部查重系统是权威的查重机构，也是国家机构。很多大学都用学校内部查重系统；英文论文也是按文章收费的，不是按字数计算的。论文的几种收费类型主要分为本科论文、硕士论文和期刊论文；我们今天讨论的是本科毕业生论文，他的收费标准是每篇198篇，其实价格和其他专业一样；网上有很多免费论文查重也可以查重英语论文，比如paperfree。 定稿查重要选择跟学校一致的论文查重系统，跟学校不一样的查重系统查重结果远远达不到标准。即使查出的重复率很低，最终提交给学校也是不合格的，因为不同的论文查重系统数据库是不一样的。 当然，因为英语论文查重价格会比较高，所以我们可以在初稿的时候选择一些正规的免费平台。正式定义必须在不泄露论文的前提下，找到更多的论文查重平台进行查重，这样可以节省很多费用。当然，在定稿的时候，要选择学校要求的系统进行查重。否则，如果我们的重复率不合格，我们就不能毕业。

关于学校查重率、相似率、抄袭率： 各个学校不一样，全文重复率在30%一下（而有的学校，本科是20%）。每章重复率应该没有要求，这个每个六四学校会出细则的，并且学校也出给出他们查重复率的地方——基本都是中国知网。

国外的以turnitin为主，国内的以知网为主。主要看学校以什么为准。其他的国内的维普好像也可以查。查出来后需要对重复的地方进行释义(paraphase)，可以采用paraphrase工具加快修改。

国外期刊怎么检索

谷歌学术是一个可以免费搜索外文学术文章的搜索引擎，包括了世界上绝大部分出版的学术期刊，谷歌学术可了解有关某一领域的学术文献；了解某一作者的著述，并提供书目信息（引用时必需的图书出版信息或期刊论文的刊名、刊期信息）。部分文献可直接下载。

Elsevier（sciencedirect）是荷兰一家全球著名的学术期刊出版商，每年出版大量的学术图书和期刊，大部分期刊被SCI、SSCI、EI收录，是世界上公认的高品位学术期刊。

Web of Science是获取全球学术信息的重要数据库，它收录了全球13000多种权威的、高影响力的学术期刊，内容涵盖自然科学、工程技术、生物医学、社会科学、艺术与人文等领域。Web of Science 包括著名的三大引文索引数据库(SCI、SSCI、A&HCI)。

Wiley Online Library为全学科期刊全文数据库，出版物涵盖学科范围广泛——包括化学、物理学、工程学、农学、兽医学、食品科学、医学、护理学、口腔医学、生命科学、心理学、商业、经济学、社会科学、艺术、人类学等多个学科大约1600多种期刊，以及很多其它重要的跨学科领域的期刊。

SpringerLink是全球最大的在线科学、技术和医学(STM)领域学术资源平台。Springer 的电子图书数据库包括各种的Springer图书产品，如专著、教科书、手册、地图集、参考工具书、丛书等。具体学科涉及：数学、物理与天文学、化学、生命科学、医学、工程学、计算机科学、环境科学、地球科学、经济学、法律。

ProQuest商业信息、学术研究、应用科技数据库涉及商业管理、社会与人文科学、科学与技术、金融与税务、医药学等广泛领域。提供期刊、报纸、参考书、参考文献、书目、索引、地图集、绝版书籍、记录档案、博士论文和学者论文集等各种类型的信息服务，其中ProQuest Dissertations & Theses Global（PQDT Global）是目前世界上规模最大、使用最广泛的博硕士论文数据库。

PubMed 是一个免费的搜寻引擎，提供生物医学方面的论文搜寻以及摘要的数据库。它的数据库来源为MEDLINE。其核心主题为医学，但亦包括其他与医学相关的领域，像是护理学或者其他健康学科。提供指向全文提供者（付费或免费）的链接。

EI在全球的学术界、工程界、信息界中享有盛誉，是科技界共同认可的重要检索工具。涉及领域：机械工程、机电工程、船舶工程、制造技术、矿业、冶金、材料工程、金属材料、有色金属、陶瓷、塑料及聚合物工程等。

IEEE（Institute of Electrical & ElectronicsEngineers）是电气电子工程师协会IEEE和国际工程技术协会IET的全文库。IEEE致力于电气、电子、计算机工程和与科学有关的领域的开发和研究，在太空、计算机、电信、生物医学、电力及消费性电子产品等领域已制定了1300多个行业标准，现已发展成为具有较大影响力的国际学术组织。

百度学术于2014年6月上线，是百度旗下的免费学术资源搜索平台，提供海量中英文文献学术资源，涵盖各类学术期刊、学位、会议论文，部分文献可直接下载。

sci-hub专门免费下载外文文献，但网站经常换域名，有时不稳定，新域名也有卡顿打不开现象，而且没有收录新文献，目前2022年文献基本下不到。

学术文献下载器（)，把海量中外文献数据库资源整合一起，涵盖上面提到的文献数据库，文献资源庞大涉及全科，包括谷歌学术和sci-hub下载不了的文献。适合学校资源不够的高校生或者是单位没有数据库资源的科研人员查阅下载文献资料。

找对方向用对工具可大幅提升学习和研究效率！下面是查找下载英文文献常用网站及文献数据库介绍，可根据自己研究的领域方向去对应的文献数据库中查找文献。

一、文献党下载器（）：该网站几乎整合汇聚了所有文献数据库资源，涵盖各种类型文献覆盖全科。

文献党下载器整合汇集的部分常用文献数据库资源如下：

中文数据库：知网、万方、维普、读秀/超星、皮书、慧科新闻搜索研究数据库、人大报刊复  印资料等等。

英文数据库：SpringerLink、Elsevier（sciencedirect）、Wiley 、Web of Science、PubMed 、EI、ProQuest（国外学位论文）等等，这些都是查找英文文献的常用权威数据库。还有大量的世界知名期刊，如：nature《自然》、science《科学》、CELL《细胞》、PNAS《美国科学院院报》，世界医学顶尖期刊：《柳叶刀》The Lancet、《新英格兰医学期刊》NEJM、《美国医学会杂志》JAMA、《英国医学期刊》BMJ等等。

文献党下载器不仅资源多，权限也高很多同学在自己学校下载不了的文献在这里下载到了，包括sci-hub和谷歌学术下载不了的文献。

二、谷歌学术：免费检索英文文献，输入英文关键词检索相关文献，可了解有关某一领域的学术文献；了解某一作者的著述，并提供书目信息（引用时必需的图书出版信息或期刊论文的刊名、刊期信息）。但只有部分文献可直接下载。

三、sci-hub：免费下载英文文献的网站，通过文献DOI检索文献并下载，不过网站不太稳定会经常更换域名，而且没有新文献，目前2022年之前的文献可以用这个站检索试试。2022年及之后文献sci-hub还没有收录。

四、Web of Science：是获取全球学术信息的重要数据库，内容涵盖自然科学、工程技术、生物医学、社会科学、艺术与人文等领域。其中以SCIE、SSCI、A&HCI等引文索引数据库，JCR期刊引证报告和ESI基本科学指标享誉全球科技和教育界。查SCI期刊文献、查期刊影响因子都可。

五、Elsevier（sciencedirect）：是荷兰一家全球著名的学术期刊出版商，每年出版大量的学术图书和期刊，大部分期刊被SCI、SSCI、EI收录，是世界上公认的高品位学术期刊。scienceDirect是爱思唯尔公司的全文数据库平台，是全球最大的科学、技术与医学全文电子资源数据库，提供2500余种学术期刊以及37000余种图书的全文内容。包括全球影响力极高的CELL《细胞杂志》、THE LANCET《柳叶刀杂志》等。

六、Wiley： 作为全球最大、最全面的经同行评审的科学、技术、医学和学术研究的在线多学科资源平台之一，Wiley Online Library为全学科期刊全文数据库，出版物涵盖学科范围广泛——包括化学、物理学、工程学、农学、兽医学、食品科学、医学、护理学、口腔医学、生命科学、心理学、商业、经济学、社会科学、艺术、人类学等多个学科大约1600多种期刊，20000本电子图书，170多种在线参考工具书，580多种在线参考书，19种生物学、生命科学和生物医学的实验室指南（Current Protocols），17种化学、光谱和循证医学数据库（Cochrane Library）。

七、ProQuest：学位论文全文数据库，是将ProQuest公司PQDD文摘库（现名PQDT）中适合中国科研人员科研和教学使用的论文全文建设而成，并向全国百数家科研教学单位的读者提供全文服务。是目前国内最完备、高质量、唯一的可以综合查询国外学位论文全文的数据库。

八、SpringerLink：是全球最大的在线科学、技术和医学(STM)领域学术资源平台。Springer 的电子图书数据库包括各种的Springer图书产品，如专著、教科书、手册、地图集、参考工具书、丛书等。具体学科涉及：数学、物理与天文学、化学、生命科学、医学、工程学、计算机科学、环境科学、地球科学、经济学、法律。

知网查询英文文献的方法

1、首先打开知网，找到检索框后面的高级检索，如图所示。

2、进入高级检索后，点击“旧版”，进入旧版界面，查询更加方便。如图所示。

3、进入旧版界面后，再次从右侧找到“高级检索”功能，如图所示。

4、在高级检索界面中输入检索条件，然后点击右下角的“检索”，如图所示。

5、检索后，在检索结果中找到右上方的“外文文献”按钮，点击切换成外文文献，如图所示。

6、之后，就可以筛选出检索结果中的外文文献，其中即可找到英文文献，如图所示。

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:张立国、石建党、冯剑利、李钟、张琚. Type IV collagenase (matrix metalloproteinase-2 and-9) in prostate cancer. PROSTATE CANCER AND PROSTATIC DISEASES 吴荃，周颖，陈林峰，石建党，王春雨，苗琳，Mocker, H; Park, I;李钟，张琚. Benign prostatic hyperplasia (BPH) epithelial cell line BPH-1 induces aromatase expression in prostatic stromal cells via prostaglandin E2. JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY王春雨，石建党，闫春和，吴荃，Klocker, H; Park, I;李钟，张琚. Development of a cell-isolation method for human prostatic smooth muscle cells based on cell type-specific activation of the SM22 gene promoter. BJU INTERNATIONALZhang, J; Qi, HX; Wang, HJ; Hu, P; Ou, LL; Guo, SH; Li, J; Che, YZ;Yu,YT; Kong, DL. Engineering of vascular grafts with genetically modified bone marrow mesenchymal stem cells on poly (propylene carbonate) graft. ARTIFICIAL ORGANS张智松王亮梅玫朱彦杜小玲李钟Irwin Park张琚石建党. Both nongenomic and genomic effects are involved in estradiol’s enhancing the phenotype of smooth muscle cells in cultured prostate stromal cells. The Prostate樊官伟高秀梅王宏朱彦张琚胡黎明Yan-Fang Su, Li-Yuan Kang,张伯礼. The anti-inflammatory activities of Tanshinone IIA, an active component of TCM, are mediated by estr. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology周颖肖向茜陈林锋杨睿石建党杜小玲Helmut Klocker, Irwin Park李钟张琚. Proliferation and phenotypic changes of stromal cells in response to varying estrogen/androgen levels in castrated rats. Asian Journal of AndrologyIrwin I Park, Qiang Zhang, Victoria Liu,张琚, Chung Lee. Estrogen at low concentrations acts through distinct pathways in normal versus BPH-derived prostate stromal cells. the Journal of Clinical Endocrinology张立国王春雨杨睿石建党符蓉陈林锋Helmut Klocker张琚. Real-time quantitative RT-PCR assay of prostate-specific antigen and prostate-specific membrane antigen in peripheral blood for detection of prostate cancer micrometastasis. Urol Oncol张智松段磊杜小玲马洪顺Irwin Park李钟张琚石建党. The proliferative effect of estradiol on human prostate stromal cells is mediated through activation of ERK. The Prostate吴荃石建党陈林锋王春雨Irwin Park李钟张琚. Regulation of proliferation and differentiation of prostatic stromal cells by estradiol through prostateic epithelial cells (BPH-1) in a paracrine manner. The BJU International刘树业Yu XD, Song CJ, Lu W, Zhang JD, Shi XR, Duan Y张琚. Cloning and expression of special F protein from human liver. World Journal of Gastroenterology牛远杰马腾骧张琚徐勇韩瑞发孙光. Androgen and prostatic stroma. ChinaAsian J AndrolZhou W, Park I, Pins M, Kozlowski JM, Jovanovic B,张琚,李钟, Ilio K. Dual regulation of proliferation and growth arrest in prostatic stromal cells by transforming growth factor-beta1. Endocrinology张琚Klaus Jung, Michael Lein, Glen Kristiansen, Birgit Rudolph, Steffen Hauptmann, Dietmar Schnorr, Stefan A. Loening, and Ralf Lichtenhagen. Differential expression of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in human primary cultured prostatic cells and malignant prostate cell lines. The Prostate牛远杰徐勇张琚马腾骧. Proliferation and differentiation of prostatic stromal cells. BJU InternationalSimone T. Boesch, Stefan Corvin,张琚, Hermann Rogatsch, George Bartsch, and Helmut Klocker. Modulation of the Differentiation Status of Cultured Prostatic Smooth Muscle Cells by an a1-Adrenergic Receptor Antagonist. The ProstateFibroblast Growth Factor Levels in Cancer Cell and in Sera of Patients suffering from Proliferative Disorders of the Prostate. The Prostate 张琚, Michael W. Hess, Martin Thurnher, Alfred Hobisch, Christian Radmayr, Marcus V. Cronauer, Anton Hittmair, Zoran Culig, Georg Bartsch and Helmut Klocker. Human prostatic smooth muscle Cell in culture: Estradiol enhances expression of smooth muscle cell-specific markers. The prostateZoran culig, Alfred hobisch, Marcus V. Cronauer, Christian Radmayr, Anton Hittmair,张琚, Martin Thurnher, Georg Bartsch and Helmut Klocker. Regulation of prostatic growth and function by peptide growth factors. The prostateMathias ziegler, Dierk Jorcke,张琚, Rainer Schneider, Helmut Klocker, Bernhard Auer, Manfred Schweiger. Characterization of Detergent-Solubilized Beef Liver Mitochodrial NAD?glycohydrolase and its Truncated Hydrosoluble Form. Biochemistry 张琚, Mathias Ziegler, Rainer Schneider, Helmut Klocker, Bernhard Auer, Manfred Schweiger. identification and purification of a bovine liver mitochondrial NAD?glycohydrolase. FEBS LETTERS杨睿，张立国，符蓉，王春雨，刘树业，石建党，张琚. 实时定量PCR技术检测前列腺癌微小转移的研究. 南开大学学报于林，王春雨，杨睿，王亮，石建党*，张琚. TAT-GFP-ERB融合蛋白的原核表达与鉴定. 南开大学学报周颖,杨睿,石建党*,刘杰,杜小玲,王克明,张琚*. BPH间质细胞增殖和表型转化与雌激素受体α表达的关系. 解剖学报苗琳,石建党*,周颖,杜小玲,吴荃,王克明,张琚*. BPH-1通过分泌PGE2上调前列腺间质细胞ERR?的表达. 中国生物化学与分子生物学报张智松,刘杰,杜小玲,段磊,张琚*,石建党. 雌激素快速激活MAPK途径促进前列腺间质细胞的增殖. 中国生物化学与分子生物学报Rui Yang, Yu-Xia Ma, Lin-Feng Chen, Ying Zhou1, Zhan-Po Yang, Yan Zhu, Xiao-Ling Du, Jian-Dang Shi*, Hong-Shun Ma, Ju Zhang*. Antagonism of estrogen-mediated cell proliferation by raloxifene in prevention of ageing-related prostatic hyperplasia. Asian Journal of Andrology苗琳;周颖;石建党;杜小玲;焦鸿丽;张琚. 雌二醇通过TGFβ1促进前列腺间质细胞MMP-2的表达. 中国生物化学与分子生物学报 Miao, Jiandang Shi , Chun-Yu Wang, Yan Zhu, Xiaoling Du, Hongli Jiao, Zengnan Mo, Helmut Klocker, Chung Lee, . Estrogen receptor-related receptor alpha mediates up-regulation of aromatase expression by prostaglandin E2 in prostate stromal cells. Mol EndocrinolRui Yang, Da Xu, Jiandang Shi*, Helmut Klocker, Chung Lee, Ju Zhang*. Tanshinone IIA inhibits estrogen/androgen induced prostatic stromal hyperplasia. The Journal of Urology Yu, Jiandang Shi, Chun Yu Wang, Helmut klocker, Doris Mayer*, Ju Zhang*. Estradiol promotes the invasive potency of prostate cancer cells in a paracrine manner through stimulation of prostatic stromal cells. The Journal of Urology . Zhang, L. Wang, . Ma, . Du, J. Zhang*, . Shi* . nongenomic and genomic effects are involved in estradiol’s enhancing the phenotype of smooth muscle cells in cultured prostate stromal cells(AUA). The Journal of Urology . Zhou, . Xiao, R. Yang, . Shi*, . Du, J. Zhang*. Dynamic changes of stromal cell in the process of estrogen/androgen induced prostatic stromal hyperplasia in castrated rats. The Journal of Urology 贾金铭;马卫国;焦拥政;王家辉;罗少波;张琚;张智松. 癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞作用机制的实验研究. 中国中西医结合杂志刘树业;杜智;商国强;贾艳慧;段缨;宋佐莉;张琚.. 肝癌中C53的表达及临床病理表现初探. 分子诊断与治疗杂志 马卫国;贾金铭;焦拥政;王家辉;罗少波;张琚;石建党;张智松. 癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞Fibronectin和Collagen IV基因表达的影响. 中国男科学杂志马卫国;贾金铭;焦拥政;王家辉;罗少波;张琚;石建党;张智松. 癃必消胶囊对体外培养的人前列腺增生间质细胞TGF-β1和Smoothelin基因表达的影响. 中华男科学杂志袁庆东;肖向茜;梁承;张琚;赵建国. 电针用于治疗大鼠实验性前列腺增生症的机制研究. 中国康复医学杂志 樊官伟;王虹;张琚;高秀梅. 植物雌激素的临床价值. 国外医药（植物药分册）Iris Corvin,Christoph Maneschg,Marcus Bartsch Jr,Ju Zhang,Arnulf Stenzl,Georg Bartsch,Helmut Klocker.. Selective culture conditions for different types of primary human bladder cells. World J Urol 樊官伟，张琚，高秀梅. 选择性雌激素受体调节剂. 医学分子生物学杂志Yu Lin; Wang Chunyu; Shi Jiandang; Miao Lin; Du Xiaoling; Mayer Doris; Ju Zhang*. Estrogens Promote Invasion of Prostate Cancer Cells in a Paracrine Manner through Up-Regulation of Matrix Metalloproteinase 2 in Prostatic Stromal Cells. EndocrinologyLinjian Mo, Ju Zhang, Jiandang Shi, Qiang Xuan, Xiaoli Yang, Min Qin,Chung Lee, Helmut Klocker, Qingdi Quentin Li and Zengnan Mo. Human Kallikrein 7 Induces Epithelial?Mesenchymal Transition-like Changes in Prostate Carcinoma Cell. Anticancer Cui , ZhongLian Li , ErPeng Zhao , YanFeng Jia , DongHua Li , Ju Zhang and NaiQiang Cui. Overexpression of Sterol Carrier Protein 2 in Patients with Hereditary Cholesterol Gallstones. BMC Gastroenterology 彭雁飞，师莹，王亮，石建党*，杨小丽，张琚*. 用腺病毒载体包装不同分化程度平滑肌细胞特异性启动子的策略分离鉴定人前列腺间质细胞亚群. 南开大学学报Lin Yu, Jiandang Shi, Sa Cheng, Yan Zhu, Xiulan Zhao, Kuo Yang, Xiaoling Du,Helmut klocker，Xiaoli Yang，Ju Zhang*. Estrogen promotes prostate cancer cell migration via paracrine release of ENO1 from stromal cells. Molecular Endocrinology杜小玲，宁召臣，王春雨，石建党，张琚*. 类固醇激素受体辅助调节因子ARA55和TGFβ1在前列腺癌细胞中作用分子机制的研究. 南开大学学报（自然科学版）Lin Miao, Sina Grebhardt, Jiandang Shi, Isabelle Peipe, Ju Zhang, Doris Mayer. Prostaglandin E2 stimulates S100A8 expression by activating protein kinaseA and CCAAT/enhancer-binding-protein-beta in prostate cancer cells . The International Journal of Biochemistry & Cell Biology --1

I THINK IT IS GOOD. AND IT IS BETTER. PCR技术王霄鹏 推荐：栗瑞丰摘要：PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作1. PCR的基本原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。2. PCR的基本成分PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。PCR的基本操作PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成：1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。1. 基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的：l 扩增目的基因和鉴定重组子；l 克隆基因；l 基因功能和表达调控的研究；l 基因组测序；l 制备单链模板；l 致突变；2. PCR在临床上的应用l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。l 检测病原体l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。3. 在法医学中的应用例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年

请参见链接，希望能够对你有所帮助。

Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoateby Escherichia coli transformant cells coexpressingthe carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes由共表达碳酰还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌转化细胞合成纯光学（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯Abstract The asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate((S)-CHBE) was investigated. Escherichia coli cells expressing both the carbonyl reductase (S1) gene from Candida magnoliae and the glucose dehydrogenase (GDH) gene from Bacillus megaterium were used as thecatalyst. In an organic-solvent-water two-phase system,(S)-CHBE formed in the organic phase amounted to M (430 g/l), the molar yield being 85%. E. coli transformant cells coproducing S1 and GDH accumulated M (208 g/l) (S)-CHBE in an aqueous monophase system by continuously feeding on COBE, which is unstable in an aqueous solution. In this case, the calculated turnover of NADP+ (the oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) to CHBE was 21,600 mol/mol. The optical purity of the (S)-CHBE formed was 100% enantiomeric excess in both systems. The aqueous system used for the reduction reaction involving E. coli HB101 cells carrying a plasmid containing the S1 and GDH genes as a catalyst is simple. Furthermore, the system does not require the addition of commercially available GDH or an organic solvent. Therefore this system is highly advantageous for the practical synthesis of optically pure (S)-CHBE.本本篇文献研究了利用COBE不对称合成（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE）。大肠杆菌细胞作为催化剂同时表达了来自念珠菌属magnoliae的碳酰还原酶和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因。在水/有机溶剂两相体系中，(S)-CHBE在有机相中的浓度可以达到（430g/l），摩尔产率达到85%。大肠杆菌的副产物S1和GDH也达到了（208g/l），COBE在水相中不稳定，所以(S)-CHBE可以在水单相中不停的生成。在这种情况下，适当的从NADP+到CHBE的转变达到了21,600 mol/mol。所形成的CHBE的旋光度在这种体系中100%对映体过量。在水相中用携带含有S1和GDH基因质粒的E. coli HB101作为催化剂不对称还原是比较简单的。并且，这种体系并不额外需要商业GDH或者有机溶剂。因此，这种体系对于实际合成纯光学活性的(S)-CHBE是非常方便的。Optically active 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid esters are useful chiral building blocks for the synthesis of pharmaceuticals. The (R)-enantiomer is a precursor of L-carnitine (Zhou et al. 1983), and (S)-enantiomer is an important starting material for hydroxymethylglutaryl- CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors (Karanewsky et al. 1990). Many studies have described the microbial or enzymatic asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoic acid esters (Aragozzini and Valenti 1992; Bare et ; Hallinan et al. 1995; Patel et al. 1992; Shimizu et al. 1990; Wong et al. 1985) based on the reduction by baker’s yeast (Zhou et al. 1983).We have previously showed that Candida magnoliae AKU4643 cells reduced ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate (COBE) to (S)-CHBE with an optical purity of 96% enantiomeric excess (.) (Yasohara et al. 1999). As this yeast has at least three different stereoselective reductases (Wada et al. 1998, 1999a, b), the (S)-CHBE produced by this yeast was not optically pure. From among these three enzymes, an NADPH-dependent carbonyl reductase, designated as S1, was purified and characterized in some detail (Wada et al. 1998). We cloned and sequenced the gene encoding S1 and overexpressed it in Escherichia coli cells. This E. coli transformant reduced COBE to optically pure (S)-CHBE in the presence of glucose, NADP+, and commercially available glucose dehydrogenase (GDH) as a cofactor generator (Yasoharaet al. 2000). Here, we describe the construction of three E. coli transformants coexpressing the S1 from C. magnoliae and GDH from Bacillus megaterium genes and analyze the reduction of COBE catalyzed by these strains. Previous reports on the enzymatic reduction of COBE to (R)-CHBE with an optical purity of 92% . (Kataoka et al. 1999; Shimizu et al. 1990) recommended an organic- solvent two-phase system reaction for an enzymatic or microbial reduction, because the substrate (COBE) is unstable in an aqueous solvent and inactivates enzymes. We examined the reduction of COBE to optically pure (S)-CHBE by E. coli transformants in a water monophase system reaction and discuss the possible use of this type of reaction system in industrial applications。具有旋光性的（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯在药物制剂的合成中是重要的手性化合物。其右旋体是L-卡尼汀的前体，其左旋体是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂的起始材料。许多研究描述了以面包酵母为基础微生物或者酶的COBE的不对称还原。我们先前已经知道利用来自念珠菌属magnoliae AKU4643 细胞催化COBE生成光学纯度96%的CHBE。这种酵母至少有三种立体选择性的还原酶，这种酵母产生的CHBE并非纯光学的，在这三种酶之中，NADPH-依赖碳酰还原酶，我们克隆并测序编码S1的基因，并在大肠杆菌中过表达。大肠杆菌转化细胞在葡萄糖，NADP+和商业化的葡萄糖脱氢酶作为辅酶因子的启动子催化COBE生成纯光学的CHBE。我们构建这三种大肠杆菌转化细胞共表达来自的S1和来自巨大芽孢杆菌的GDH，并分析COBE被这几种菌株催化还原的反应机理。先前的报道表明，利用酶催化还原COBE生成CHBE光学纯度可达92%，也提到了因为底物（COBE）在水相中不稳定，并且酶容易钝化，所以利用酶或者微生物在有机溶剂/水两相体系中催化反应。我们研究了在水单相体系中由COBE还原生成纯光学的CHBE，还讨论了这种反应体系在工业应用中可能的用途。Materials and methodsBacterial strain and plasmids The E. coli strains used in this study were JM109 and pGDA2, in which the GDH gene from B. megaterium is inserted into pKK223-3, was kindly provided by Professor I. Urabe, Osaka University (Makino et al. 1989). Plasmids pSL301 and pTrc99A were purchased from Invitrogen (USA), and Amersham Pharmacia Biotech (UK), respectively. Plasmids pUC19 and pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995) were purchased from Takara Shuzo (Japan).材料和方法菌株和质粒本次实验中使用的大肠杆菌是JM109 and HB101。来自B. megaterium的GDH基因插入到Pkk233-3质粒中，而带有GDH基因片段的pGDA2质粒由到由大阪大学的urabe教授提供。质粒pSL301和 pTrc99A是由美国的Invitrogen公司和英国的公司分别购买的。质粒pUC19和pST28是由日本takara公司购买的。The recombinant plasmid used in this study was constructed as follows (Fig. 1): Plasmid pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kilobase pairs (kb) including the GDH gene. This fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSL301 to construct plasmid pSLG. Plasmid pSLG was double-digested with EcoRI and XhoI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene.这次实验使用的重组质粒构建如下：质粒pGDA2 被EcoRI 和 PstI双酶切从而分离出一个大小约为的包含有GDH基因的DNA片段。这个片段被插入到质粒Psl301的EcoRI-PstI酶切位点从而构建出质粒pSLG。质粒pSLG被EcoRI和XhoI To construct plasmid pNTS1G, this fragment was inserted into the EcoRI-SalI site of pNTS1, which was constructed to overproduce S1 as described previously (Yasohara et al. 2000). To construct plasmid pNTGS1, plasmid pNTG was first generated. Two synthetic primers (primer 1, TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG,and primer 2 TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT) were prepared for polymerase chain reaction (PCR) using pGDA2 as the template. The PCR-generated fragment was double- digested with NdeI and EcoRI and then inserted into the NdeI EcoRI site of plasmid pUCNT, which was constructed from pUC19 and pTrc99A, as reported (Nanba et al. 1999), to obtain pNTG. To construct plasmid pNTGS1, two synthetic primers (primer 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and primer 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC) were prepared using pUCHE, which contains the S1 gene as the template. The PCR-generated fragment was double-digested with EcoRI and SalI and then inserted into the EcoRI-SalI site of pNTG to obtain pNTGS1. Plasmid pNTS1G, pNTGS1 or pNTG was transformed into E. coli HB101.构建pNTS1是为了过表达前文所提到的S1，这个大小的片段被插入到pNTS1的EcoRI-SalI酶切位点从而构建pNTS1G。为了构建质粒pNTGS1，首先需要构建pNTG。两个合成引物（引物1，TAGTCCATATGTATAAAGATTTAG和引物2，TCTGAGAATTCTTATCCGCGTCCT）和作为模板的pGDA2是PCR反应需要的。PCR得到的片段是由NdeI 和EcoRI双酶切和并插入到质粒pUCNT的NdeI EcoRI酶切位点来得到pNTG。根据报道，pUCNT是由pUC19和 pTrc99A构建而来。为了构建质粒pNTGS1，两个合成引物(引物 3, GCCGAATTCTAAGGAGGTTAATAATGGCTAAGAACTTCTCCAACG, and 引物 4, GCGGTCGACTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGTC)，包括了S1基因作为模板。Pcr产物片段被EcoRI和SalI双酶切然后被插入到pntg的EcoRI-SalI酶切位点得到pntg1.质粒pNTS1G, pNTGS1或者 pNTG都是导入大肠杆菌 pGDA2 was double-digested with EcoRI and PstI to isolate a DNA fragment of about kb including the GDH gene. To construct plasmid pSTVG, this fragment was inserted into the EcoRI-PstI site of plasmid pSTV28. Plasmid pSTVG was transformed into E. coli HB101. 质粒pGDA2被EcoRI 和 PstI双酶切得到包含GDH基因的大小的DNA片段。为了构建pSTVG质粒，这个片段被插入到pSTV28质粒的EcoRI-PstI的酶切位点。pSTVG质粒被导入到E. coli HB101。Medium and cultivationThe 2×YT medium comprised Bacto-tryptone, yeastextract, and NaCl, pH . E. coli HB 101 carrying pNTS1,pNTG, pNTS1G, or pNTGS1 was inoculated into a test tube containing2 ml 2×YT medium supplemented with mg/ml ampicillin,followed by incubation at 37 °C for 15 h with reciprocal preculture ( ml) was transferred to a 500-ml shakingflask containing 100 ml 2×YT medium. The cells were cultivatedat 37 °C for 13 h with reciprocal shaking. E. coli HB101 carryingpNTS1 and pSTVG was similarly cultivated in 2×YT mediumsupplemented with mg/ml ampicillin and mg/ml chloramphenicol.培养基和培菌2*YT培养基 包含有细菌用胰蛋白胨，酵母提取物， NaCl，.携带有pNTS1,pNTG, pNTS1G, 或 pNTGS1的大肠杆菌HB101被接种到有氨苄青霉素的2ml的2*YT培养基，37°C摇床15小时。将菌液接种到100ml2*YT培养基的500ml烧瓶中。在37°C摇床培养13小时。携带有pNTS1 和 pSTVG质粒的大肠杆菌HB101在2*YT培养基中培养方法相似，只是培养基中要加入 mg/ml的氨苄青霉素和 mg/ml的氯霉素。Preparation of cell-free extracts and the enzyme assay Cells were harvested from 100 ml of culture broth by centrifugation, suspended in 50 ml of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), and then disrupted by ultrasonication. The cell debris was removed by centrifugation; the supernatant was recovered as the cell-free extract. Carbonyl reductase S1 activity (COBE-reducing activity) was determined spectrophotometically as follows: The assay mixture consisted of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), mM NADPH, and 1 mM COBE. The reactions were incubated at 30 °C and monitored for the decrease in absorbance at 340 nm. The assay mixture for GDH activity consisted of 1 M Tris-HCl buffer (pH ), 100 mM glucose, and 2 mM NADP+. The reactions were incubated at 25 °C and monitored for the increase in absorbance at 340 nm. One unit of S1 or GDH was defined as the amount catalyzing the reduction of 1 μmol NADP+ or oxidation of 1 μmol NADPH per minute, respectively. Protein concentrations were measured with a proteinassay kit containing Coomassie brilliant blue (Nacalai Tesque, Japan),using bovine serum albumin as the standard (Bradford 1976).无细胞抽提液和酶鉴定将100ml培养液离心收获菌体，用为的磷酸缓冲液悬浮，然后超声粉碎。细胞碎片通过离心可以去除，收集上层清液就是无细胞抽提物。碳酰还原酶S1的活性由分光光度计测量如下：测定的混合物包括：的磷酸二氢钾缓冲液，和1mMCOBE。反应在30°C条件下反应，并且随时监测其在340nm处的吸光值。测GDH混合物包括：1M pH 的Tris-HCl的缓冲液，100mM的葡萄糖，2mM的NADP+。反应在25°C下进行，监测其在340nm处的吸光值。一个单位S1或GDH被定义为每分钟催化还原1μmol NADP+或氧化1 μmol NADPH的量。蛋白质的测定通过含有考马斯亮蓝的蛋白质测定试剂利用牛血清白蛋白作为标准进行测定。Study of enzyme stabilityOne milliliter of 100 mM potassium phosphate buffer (pH ) containing the cell-free extracts of E. coli HB101 carrying pNTS1 (S1: 20 U/ml) was mixed with an equal volume of each test organic solvent in a closed vessel. After the mixture was shaken at 30 °C for 48 h, the remaining enzyme activities in an aqueous phase were assayed as described above. The mixture, containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH ), S1 (20 U/ml), and various concentrations of CHBE, was incubated at 30 °C for 24 h in order to study the enzyme’s stability in the presence of remaining enzyme activities were assayed as described above.酶稳定性的研究一毫升含有含有pNTS1质粒的E. coli HB101的无细胞抽提液的100mM磷酸氢二钾缓冲液（）与等体积的有机溶剂混合。混合物在30 °C震摇48小时后，水相中残留的酶活力即是上述的酶活力。COBE reduction with E. coli cells expressing the S1 gene and E. coli cells expressing GDH genes in a two-phase system reaction The reaction mixture comprised 15 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG, 17 ml culture broth of E. coli HB101 carrying pNTS1, mg NADP+, 4 g glucose, g COBE, 25 ml n-butyl acetate, and about 25 mg Triton X-100. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. At 2 h, g COBE and g glucose were added to the reaction mixture. To compare the reaction by E. coli transformant coexpressing the GDH and S1 genes, 30 ml culture broth of E. coliHB101 carrying pNTS1G was used instead of culture broth of E. coli HB101 carrying pNTG and E. coli HB101 carrying pNTS1. Other components and the procedure were the same as described above.表达S1基因和GDH基因的大肠杆菌细胞在两相反应体系中的还原反应混合物包含有带有pNTG质粒的大肠杆菌HB101的菌液15ml，pNTS1质粒的大肠杆菌HB101的菌液17ml， mg NADP+，4 g葡萄糖，的COBE，25ml的n-butyl acetate丁酰醋酸盐和大约25mg的聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。用5M的NaOH溶液将pH控制在。在反应两小时后，加入和葡萄糖到该混合物中。比较大肠杆菌转化细胞共表达GDH和S1基因，携带有pNTS1G质粒的大肠杆菌HB10130ml菌液取代了携带有pNTG和pNTS1质粒的大肠杆菌HB101菌液。其他的成分和步骤和上述的方法相似。 COBE reduction to (S)-CHBE in a two-phase system reaction The reaction mixture contained 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, 10 g COBE, 50 ml n-butyl acetate, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C, and the pH was controlled at with 5 M sodium hydroxide. Five grams of COBE/ g glucose and 10 g COBE/11 g glucose were added to the reaction mixture at 3 h and 7 h, respectively; mg NADP+ was added at 26 在两相系统中还原生成（S）-CHBE反应混合物包含50ml E. coli HB101转化细胞的培养液，葡萄糖，10gCOBE，50ml丁酰醋酸，和大概50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100.在30°C温度下将其混合均匀，并用5M的NaOH溶液将pH控制在。在第3小时加入5gCOBE和葡萄糖或者在第7小时加入10gCOBE和11g葡萄糖，分别在第26小时加入。 COBE reduction to (S)-CHBE in an aqueous system reaction The reaction mixture was made up of 50 ml of culture broth of an E. coli HB101 transformant, mg NADP+, 11 g glucose, and about 50 mg Triton X-100. The reaction mixture was stirred at 30 °C. Fifteen grams of COBE was fed continuously by means of a micro-feeding machine at a rate of about g/min for about 12 h. The pH of the reaction mixture was controlled at with 5 M sodium hydroxide. The reaction mixture was extracted with 100 ml ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo. COBE在水相中还原成(S)-CHBE的反应反应的体系是由50ml大肠杆菌HB101转化细胞的菌液，，11g葡萄糖和大约50mg聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100。反应混合物在30°C15mg的COBE通过微量添加机器以 g/min的速率连续12小时恒定的加入到体系中。用5M的NaOH溶液将pH控制在。反应混合物用100ml乙酸乙酯萃取。有机层用无水硫酸钠吸干，并在真空中脱水。Analysis The organic layer was obtained on centrifugation of the reaction mixture and was assayed for CHBE and COBE by gas chromatography. Optical purity of CHBE was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), as described previously (Yasohara et al. 1999).Enzymes and chemicals Restriction enzymes and DNA polymerase were purchased fromTakara Shuzo (Japan). COBE (molecular weight: ) was purchasedfrom Tokyo Kasei Kogyo (Japan). Racemic CHBE (molecularweight: ) was synthesized by reduction of COBE withNaBH4. All other chemicals used were of analytical grade andcommercially available.分析离心反应混合物得到的有机层通过气相色谱法测定其CHBE和COBE。COBE的光学纯度如前所述通过高效液相色谱法进行分析。酶和化学试剂限制性内切酶和DNA聚合酶由takara公司购得，COBE（分子量：）由东京Tokyo Kasei Kogyo公司购得，消旋体CHBE（分子量）通过COBE及NaBH4合成。所有其他化学试剂都是分析等级和商业化的试剂。Construction of E. coli transformants overproducing S1 and GDHTo express the carbonyl reductase S1 and GDH genes in the same E. coli cells, four expression vectors were constructed (Fig. 1). Plasmids pNTS1G and pNTGS1 contain the S1 gene from C. magnoliae, the GDH gene from B. megaterium, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. Plasmid pNTS1 contains the S1 gene, the lac promoter derived from pUC19, and the terminator derived from pTrc99A. The enzyme activities in cell-free extracts of the E. coli transformants are shown in Table 1. E. coli HB101 cells carrying the vector plasmid pUCNT had no detectable S1 or GDH activity. E. coli HB101 carrying either pNTS1G or pNTGS1 showed S1 and GDH activity without isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. The S1 activities of these two transformants were lower than the GDH activities. To obtain a transformant whose S1 activity was equal to or greater than the level of GDH activity, we used a lower copy vector, pSTV28 (Homma et al. 1995; Takahashi et al. 1995), to express the GDH gene. It may be possible to raise the S1 activity by lowering the GDH activity. Plasmid pSTVG contains the GDH gene, the lac promoter, the chloramphenicol resistance gene, and the replicative origin derived from pACYC184 for compatibility with the plasmid pNTS1. In E. coli HB101 carrying pNTS1 and pSTVG, the S1 activity was higher than the GDH activity, but this GDHlevel may be too low to regenerate in a COBE reduction reaction as described below.过产生S1和GDH的大肠杆菌转化细胞的构建为了在同一大肠杆菌细胞中表达碳酰还原酶S1和GDH基因，要构建四个表达型载体。质粒pNTS1G 和 pNTGS1包含有来自C. magnoliae的S1基因，来自B. megaterium的GDH基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子，质粒pNTS1包含有S1基因，来自pUC19的LAC启动子，从pTrc99A的来的终止子。在大肠杆菌转化细胞的无细胞抽提物的酶活力如表一所示。携带有运输质粒pUCNT的大肠杆菌细胞无法检测到其S1和GDH活性。携带有pNTS1G 或 pNTGS1质粒在没有IPTG的诱导下有S1和GDH的活性。在这两个转化菌种中，S1的活力小于GDH的活力。为了得到S1活性等于或者大于GDH的大肠杆菌转化菌株，我们使用低拷贝的载体pSTV28，来表达GDH基因。它可能可以通过降低GDH的活性从而提高S1的活性。质粒pSTVG包含有GDH基因，lac启动子，和氯霉素抗性基因，以及与pNTS1具有相容性的从pACYC184得来的复制起始位点。在携带有pNTS1和pSTVG的大肠杆菌转化细胞中，S1的活性要高于GDH的活性，但是GDH的活性可能会太低而在COBE还原反应中不能再生。 太长了，字数有限制，所以不能发完。分数我无所谓啦，我很少登录的。这应该算是基因工程的吧，是我以前自己翻的，不是很好。如果你要的话可以联系我的邮箱。

毕业论文怎么检测

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