检测酶活力的论文

检测酶活力的论文

【目的和要求】1. 了解谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2. 掌握谷丙转氨酶活性测定的方法。【实验原理】血清谷丙转氨酶(SGPT)能催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2，4－二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在520nm处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。GPT在肝脏中含量最多，当某种药物对肝脏早晨损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损， GPT就释放到血液中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。【实验试剂和器材】（一）试剂1. 磷酸盐缓冲液（）2. 丙酮酸标准液（2μMol/ml）准确称取22mg纯净丙酮酸钠，用 磷酸盐缓冲液定容至100ml。3. 谷丙转氨酶底物溶液准确称取α－酮戊二酸（2mM）， DL－丙氨酸（200mM），溶于50ml 磷酸盐缓冲液中，用20% NaOH调pH为，然后加以上磷酸盐缓冲液至100ml，加几滴氯仿防腐，冰箱保存可放一周。4. 2，4－二硝基苯肼溶液（1mM）称取2，4－二硝基苯肼20mg，置于100ml容量瓶中，先用10ml浓盐酸溶解后，再加水稀释到刻度。5. 氢氧化钠。（二）器材试管及试管架， 、 、1及5ml吸量管，恒温水浴，722型分光光度计。【实验方法】（一）标准曲线绘制取6支干燥洁净的试管，按下表操作：以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。（二）血清SGPT活力测定取4支干燥洁净试管，按下表操作：【注意事项】1. 在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2. 标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。3. 转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。4. 溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。5. 血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。

在粮食陈化的过程中，过氧化氢酶的活性会降低，呼吸作用就减弱了；植酸酶，蛋白酶和磷脂酶活性等水解酶类都是会增加的。详细如下：粮食陈化中的有关变化1、生理变化粮食陈化的生理变化无论是含胚与不含胚的粮食主要表现为酶的活性和代谢水平的变化。粮食在储藏中，生理变化多是在各种酶的作用下进行的。若粮食中酶的活性减弱或丧失，其生理作用也随之而减弱或停止。随着陈化的进行粮食的生活力逐渐丧失，与呼吸有关的酶类，如过氧化氢酶的活性趋向降低，呼吸作用也随之减弱；而水解酶类，如植酸酶，蛋白酶和磷脂酶活性都增加。粮食在储藏中由于自身代谢的有毒产物积累也导致粮粒衰老和陈化，如吲哚乙酸和阿魏酸的积累和一些脂类氧化产物的积累都将加速粮食的陈化的进程。据报道，一些不饱和脂肪酸分解游离基与其它脂类起反应，能使细胞膜结构破坏。衰老的种子里，高尔基体散开并失水，溶酶体膜破裂，引起细胞的解体，同时细胞膜也丧失完整性而透性增强。对于有胚的粮食储藏中生理变化的指标是，随着陈化加深粮粒生活力与发芽率下降，随着细胞的劣变，细胞膜透性增强，浸出液所含的物质量增加，电导率增高。粮食陈化与酶活性的关系通常可以由一些与品质相关的酶活性变化加以反映。稻谷储藏初期含有活性较高的过氧化氢酶，淀粉酶，随着储藏时间的延长，这些酶的活性就大大减弱，生活力也下降。根据测定．稻谷储藏三年后过氧化氢酶活性降低五倍，淀粉酶等于零。大米在储藏中过氧化酶活性丧失，呼吸也趋于停止。现在人们测定粮食代谢水平，就采用过氧化氢酶的活性作为指标之一。 2、化学成分变化粮食化学成分的变化，无论含胚与不含胚的粮食，一般说多以脂肪变化较快，蛋白质其次，淀粉变化很微弱。脂肪的变化粮食储藏过程中，由于脂肪易于水解，游离脂肪酸在粮食中首先出现。特别是在环境条件适宜时，储粮霉菌开始繁殖，分泌出脂肪酶，参加脂肪水解，使粮食中脂肪酸增多，粮食陈化加深。蛋白质的变化粮食储藏过程中，受外界物理、生物等因素的影响，蛋白质的水解和变性。蛋白质水解后，游离氨基酸上升，酸度增加。蛋白质变性后，空间结构松散，肽键展延，非极性基外露，亲水基内藏，蛋白质由溶胶变为凝胶、溶解度降低，粮食陈化加深。淀粉的变化粮食储藏过程中，淀粉水解成的麦芽糖与糊精继续水解，还原糖增加，糊精相对减少，粘度下降，粮食开始陈化。 3、物理性质的变化粮食陈化时物理性质变化很大，表现为：粮粒组织硬化，柔性与韧性变弱，米质变脆，米粒起筋，身骨收缩，淀粉细胞变硬，细胞膜透性增强，糊化及吸水率降低，持水率亦降低，米饭破碎，粘性较差，口感有“陈味”。

同工酶的检测论文怎么写

临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。一、转氨酶及其同工酶（一）生物化学特性转氨酶或称氨基转移酶是一组催化氨基在氨基酸与a-酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶（ALT）和（天）门冬氨酸氨基转移酶（AST）是其中最重要的两种，前者俗称为谷丙转氨酶（GPT），后者为谷草转氨酶（GOT）。（二）体内分布AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70%存在于肝细胞线粒体中。AST有两种同工酶ASTs 和ASTm，分别存在于可溶性的细胞质和线粒体。细胞轻度损伤时ASTs 升高显著，而严重损伤时，则ASTm大量出现于血清中。正常血清所含AST的同工酶主要为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以ASTm为主。ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、心、骨骼肌等。血清ALT活性升高，通常表示肝脏损伤。ALT有两种不同活性的同工酶a（ALTs）、b（ALTm），分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。肝细胞坏死血清中以ALTm为主。（三）测定方法转氨酶的测定方法有许多种，其中以赖氏法最常用，由于此法操作简便、经济，一些小型实验室仍在使用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。ALT速率法测定中酶偶联反应式为： ALTL-丙氨酸 + a-酮戊二酸 L-谷氨酸 + L-丙酮酸 LD 丙酮酸 + NADH + H+ L-乳酸 + NAD+ AST速率法测定中酶偶联反应式为： AST L-门冬氨酸 + a-酮戊二酸 草酰乙酸 + L-谷氨酸 MD 草酰乙酸 +NADH + H+ L-苹果酸 + NAD+ 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率(-DA/min)，计算出ALT、AST的活力单位。（四）临床意义ALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临床上主要用于肝脏疾病的诊断。各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起的急性肝损害时，血清ALT 水平可在临床症状（如黄疸）出现之前就急剧升高，且ALT＞AST。一般而言，急性肝炎时血清ALT高低与临床病情轻重相平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如能同时测定AST，并计算DeRitis比值，即AST/ALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断和鉴别诊断以及判断肝炎的转归也特别有价值。急性肝炎是时DeRitis比值＜1，肝硬化时DeRitis比值≥2，肝癌时DeRitis比值≥3。重症肝炎时由于大量肝细胞坏死，血中ALT逐渐下降，而胆红素却进行性升高，出现所谓“酶胆分离”现象，常是肝坏死的前兆。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。AMI发病6～8h即升高，48～60h达到高峰，4d～5d恢复正常。但由于AST在AMI 时升高迟于CK，恢复早于LD，故诊断AMI价值不大。在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。胆道疾患时AST亦可升高。二、g-谷氨酰转移酶及其同工酶（一）生物化学特征g-谷氨酰转移酶（g-GT或GGT）又称g-谷氨酰转肽酶（g-GTP或GGTP），是一种含巯基的线粒体酶。组织分布以肾脏含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的g-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无g-GT，因此溶血对其测定影响不大。（二）测定方法目前国内外多采用连续监测法测定血清g-GT活性。IFCC参考方法采用L-g-谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为g-谷氨酰基的受体。在的条件下，g-GT催化底物生成g-谷氨酰双甘肽和黄色的2-硝基-5-氨基苯甲酸，在410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与g-GT活性成正比关系。（三）临床意义g-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。g-GT 还可用于判断恶性肿瘤有无肝转移，肿瘤患者如有g-GT 的升高，常说明有肝转移。g-GT与乙醇的摄取量有关，对乙醇性中毒的判定有相当的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有g-GT升高。用醋纤膜电泳可将g-GT同工酶分为g-GT1、g-GT2、g-GT3和g-GT4四种，正常人只见g-GT2和g-GT3。重症肝胆疾病和肝癌时常有g-GT1出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有g-GT2增加，胆总管结石及胰腺炎时g-GT2也增加。g-GT4与胆红素增高密切相关。

同工酶 介绍同工酶是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。 同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。

同工酶是一个复杂的生物现象，至今在分类、概念上还有许多问题需要进一步研究，但在临床应用上，对疾病的诊断和鉴别诊断都是很有帮助的，可以把同工酶理解为一个包括有多种能催化相同生化反应的酶族，在这一族中虽然都催化相同的生化反应，但各个同工酶在理化性质上有差异，因此可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定医|学考试网。但从根本上说，这些差异和酶蛋白结构有关，这些结构差异又可引起酶蛋白抗原性的变化，因此现在利用免疫原理来测定同工酶的方法有了很大发展，并用之于临床。

由于同工酶的分布有明显的组织差异或细胞内的定位不同，使其具有较大的临床应用意义。因为存在组织差异，所以可根据其变化来推测受损的组织或器官。例如CK MB活性增高对判断心肌梗死有意义。心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD.活性上升，且LD1>LD2则说明有心肌疾病，如果在此基础上还出现LD5>LD4则说明在心肌损伤的同时并伴有肝的损伤，例如右心衰引起肝淤血的状况。

有一些同工酶只是在细胞内定位不同，也有临床意义，这其中有诊断意义的主要是线粒体同工酶，线粒体中有些酶的性质和结构与胞质中同工酶有明显差异，有临床意义。用的较多的是线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进人血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。

另外，还发现有些同工酶在从组织进入体液后，进一步分化为几个不同的类型，即所谓同工酶亚型。CK-MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3.这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。所以，同工酶和同工酶亚型的临床应用还是很有发展前途的。

土壤酶活性测定毕业论文

土壤酶有多种存在部位及状态，其中胞内酶存在于微生物细胞内部，其直接反映了微生物活动情况，对外界刺激因素更加敏感，变化幅度较大；而胞外酶与土壤有机质、粘粒等紧密结合在一起，其性质比较稳定，对农业技术措施、环境条件及有毒物质等变化的反应规律性更强。但通常测得的酶活性是胞内酶还是胞外酶是一个重要问题。因此区分胞内、胞外组分各自对土壤酶贡献的研究是十分有意义的。 但是，由于土壤酶在土壤中的来源繁多、存在状态多变、存在结构复杂，及人们对土壤酶认识的不够深入及现阶段的科学仪器和试剂的限制，使得人们对土壤胞内、胞外酶等组分的比例关系以及各组分对微生物生物量贡献等问题尚不十分明确。所得结果不尽一致，使微生物代谢活性（胞内酶活性）和这些胞外酶活性分离的实验迄今没有有效实现。 本论文拟通过模拟方法，采用多种方法尝试区分土壤胞内、胞外酶，对各部分酶的性质和关系进行了较为系统的研究，并借助动力学手段对酶进入土壤后的变化过程和机理进行了分析，结果表明： 1.灭菌后的土壤载体能降低芳基硫酸酯酶纯酶的酶促反应初速度，粘粒含量越高，其对纯酶的抑制作用越强。随着载体浓度的增加，Km值呈增大趋势，Vmax、Vmax/Km、k值呈降低趋势，载体对芳基硫酸酯酶的作用机理为混合抑制，即土壤对酶的吸附同时发生在酶的活性位点及非活性位点上。通过载体对芳基硫酸酯酶的酶促反应初速度及动力学参数可以推断出，四种类型土壤对酶吸附能力从强到弱顺序依次为：红壤>塿土>褐土>风沙土；粘粒含量的高低是影响酶促反应的主要因素。 2.甲苯对芳基硫酸酯酶纯酶具有明显的抑制作用，降幅最大达到；土壤载体对溶液中的纯酶有很强的吸附能力；μL g-1甲苯即可完成对土壤中酶活性的激活作用，增幅达9%～198%；随甲苯浓度增加，土壤酶活性的变化幅度逐渐趋缓，其可用Langmuir模型较好地拟合，并由此获得了最大表观酶活性Umax，其与土壤性质等达到了显著相关；揭示出甲苯主要是通过杀死土壤中的微生物来影响土壤酶活性的；在供试土样中土壤芳香硫酸酯酶胞外酶和胞内酶平均分别占和。，高肥力土壤对酶较强的吸附能力使得其胞外酶含量均高于低肥力土壤。 3.氯仿熏蒸对芳基硫酸酯酶纯酶有较强的抑制作用，熏蒸12h时的抑制作用最强，氯仿熏蒸处理能显著增强土壤芳基硫酸酯酶活性，增幅为25%～454%。传统的熏蒸土壤24h的时间过长，由拟合方程计算出的理论最适熏蒸时间为16～17小时。由最大表观酶活性初步计算了土壤胞内、胞外芳基硫酸酯酶的比例关系，供试土样胞内酶含量要大于胞外酶含量。 4.诱导物质的加入显著增强了土壤微生物量碳及芳基硫酸酯酶活性，土壤酶活性的变化与土壤肥力和微生物数量密切相关。土壤诱导酶活性的增加是微生物活动引起的，因此土壤微生物对底物诱导的反应比土壤酶更敏感更直接，故土壤微生物量碳含量的增幅要大于土壤芳基硫酸酯酶活性。线性方程可较好表征土壤微生物量碳与芳基硫酸酯酶活性间的变化关系，并通过截距计算出土壤的胞内、胞外酶关系。土壤微生物也是土壤肥力的组成部分，因此用总酶活性来评价土壤肥力要比胞外或胞内酶活性更加准确。 5.芳基硫酸酯酶纯酶对微波有一定的耐受力，不考虑温度的影响时，当微波功率低于纯酶的耐受极限值时（240W），纯酶不受影响；当功率高于极限值时，随功率的增加纯酶活性逐渐降低。微波照射时间越长对土壤芳基硫酸酯酶活性的抑制作用越强，土壤温度的剧烈变化是微波照射后土壤酶活性降低的主要原因之一。根据计算得出酶活性降低50%所用微波照射时间（ET50）显示，肥力越高的土壤对微波照射越敏感。土壤芳基硫酸酯酶对微波有一个最敏感的照射功率，此时土壤酶活性的变幅最大，且这个敏感功率与纯酶的极限功率比较接近。分析表明粉粒含量越高的土壤对微波照射越敏感，揭示出土壤粉粒是吸收微波能量的主体。

土壤中过氧化氢酶活性的测定 殷晓晨，武亨杰，朱承彬 （中国石油大学 化学化工学院，山东 青岛 266555） 摘要：为了研究土壤中微生物抵御过氧化氢毒害的能力，设计实验， 摘要 采用高锰酸钾滴定法测定受石油污染并接受生物修复的各土壤样品 中过氧化氢酶的活性。研究表明，不同区域的土壤中所含过氧化氢酶 的活性不同， 说明不同区域的土壤受污染程度不同或者恢复速度有所 差异。 关键词： 关键词：土壤；过氧化氢酶；高锰酸钾滴定 中图分类号： 中图分类号：X705 文献标志码： 文献标志码：A Measurement of Catalase Activity in Soil Yin Xiao-chen, Wu Heng-jie, Zhu Cheng-bin （College of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum， Qingdao266555，China） Abstract: This experiment is designed to research the ability of microorganisms to resist the poison of peroxide. The catalase activity in soil which was contaminated by petroleum and then biologically repaired was measured by the method of titration with potassium permanganate. The research shows that the catalase activity in different districts of soil is distinct. Key words: soil; catalase; titration with potassium permanganate 过氧化氢广泛存在于生物体 和土壤中，是由生物呼吸过程和 有机物的生物化学氧化反应的结 果产生的，这些过氧化氢对生物 和土壤具有毒害作用。 与此同时， 在生物体和土壤中存有过氧化氢 氧化氢的量，表示出过氧化氢酶 的活性。本实验重点采用高锰酸 钾滴定法。 1. 实验 实验器材 本实验所用器材为恒温水浴 锅，冰箱，分析天，用时用 KmnO4 溶液标定。 土壤样品性 以 每 g 干 土 1h 内 消 耗 的 KmnO4 体积数表示（以 mL 计）表示。本实验土壤样品取自于受石2. 结果分析油污染并接受生物修复的位于东 KMnO4 标定：10mL 营市的土壤，共有 14 个土壤样 H2C2O4 用 KMnO4 滴定， 所消耗 KMnO4 品。 实验方法体积数为 ，由此计算出 KMnO4 标 准 溶 液 浓 度 为 。 H2O2 标定： 1ml 3% H2O2 用 KMnO4 滴定， 所消耗 KMnO4 体积数 为 ,由此计算出 H2O2 浓度 为 。 酶活性= 空白样剩余过氧化 （ 氢滴定体积-土样剩余过氧化氢 滴定体积）*T/土样质量 其中：酶活性单位- ml( KMnO4)/(h·g)； T- 高 锰 酸 钾 滴 定 度 的 矫 正 值 T=。 数据处理如下：分别取 5g 过 筛的风 干土壤样品于具塞三角瓶中（用 不加土样的作空白对照） ，加入 甲苯， 摇匀， 4℃冰箱中 于 放置 30min。 取出， 立刻加入 25mL 冰箱贮存的 3% H2O2 水溶液，充分 混匀后，再置于冰箱中放置 1h。 取出，迅速加入冰箱贮存的 2mol/L H2SO4 溶液 25mL，摇匀， 过滤。取 1mL 滤液于三角瓶，加 入 5mL 蒸馏水和 5mL 2mol/L H2SO4 溶液，用 高锰酸钾溶液滴定。根据对照和样品的滴 定差，求出相当于分解的 H2O2 的 过氧化氢酶活 量所消耗的 KmnO4。表1编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 土样 北中一 北中一(平行) 南右一 南右一(平行) 左一 左一 (平行) 左二 左三 右一 右二 右三 北左一 北左二 北中二 南左一 北右一 北右三 空白过氧化氢酶数据处理表滴定 2 体积数 /ml 平均体 积数/ml 酶活性 （每克干土以 1h 内消耗 的体积数表 示）滴定 1 体积数 /ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18酶活性编号图1过氧化氢酶活性柱形图3. 实验讨论用 草酸溶液标定 高锰酸钾溶液时，要先取一定量 的草酸溶液加入一定量硫酸中并 于 70℃水浴加热，开始滴定时快 滴， 快到终点时再进行水浴加热， 后慢滴，待溶液呈微红色且半分 钟内不退色即为终点。 高猛酸钾滴定过程对酸性环 境的要求很严格。经探究后发现 直接取 1mL 滤液滴定不仅液体量 太少，终点不好把握，硫酸的量 也不足，因此我组对实验方法进 行了改进，即取第2/3页1mL 滤液于三角 瓶 ， 加 入 5mL 蒸 馏 水 和 5mL 2mol/L H2SO4 溶液，再用高锰酸 钾溶液滴定，这样滴定过程极为 方便。[2] 王华芳， 展海军.过氧化氢酶 活性测定方法的研究进展.科技 创新导报，2009: . [3] 雷柏平等. 过氧化氢酶活 性的比色测定法.临床检验杂志， 1993:11-2. [4] 徐镜波，郎佩珍. 过氧化氢 酶活性及活性抑制的测定.环境 化学，. [5] 徐镜波， 袁晓凡， 郎佩珍. 过 氧化氢酶活性及活性抑制的紫外 分光光度测定. 环境化学， 1997:16-1. [6] 鲁赫明等. 农药对土壤过氧 化氢酶活性的影响.东北师范大 学报自然科学版， . [7] 傅丽君,李华亮,钟开新. 杀灭菊酯对土壤过氧化氢酶活性 的影响.生态毒理学报， （4） 2009 : 265-270. [8] 李玉瑛， 冰. 柴油污染土 李 壤生物修复对土壤酶活性的影响.参考文献：[1] 关松萌等.土壤酶及其研究 法.北京：农业出版社， 1986:121-3.生态环境学报 ,2009,18(5): 1753-1756 . [9] 王耀生等. 渗灌对保护地土 壤脲酶和过氧化氢酶活性的影响. 安徽农业科学， 2006， 34(1)： 103 —105望采纳谢谢。

因为你知道酶有最适生存条件，土壤污染就是土壤中重金属离子或者酸碱度不对，通过酶活性的改变就可以体现土壤修复程度，酶活性越高土壤修复越好

研究酶的活性论文

浅谈蛋白质折叠的有关问题 [关键字]生物 大分子 分子伴侣 蛋白质的折叠 识别 结合 生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。 蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。 一、新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。 1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。 二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。） 三，分子伴侣的作用机制 分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。 四、分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。 五、分子伴侣的结构 目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。 六、分子伴侣研究的实际应用 分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。 [参考书目] 1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科技出版社，1996年11月第一版：93-104页 2．郝柏林刘寄星主编，理论物理与生命科学，上海科学技术出版社，1997年12月第一版：29-58页 3．中国生物物理代表团，从第十三届国际生物物理大会看生物物理学研究的现状和趋势，生物物理学报，1999年第十五卷第四期：826-827页

时间流逝，不知不觉，改革开放已经走过了三十年的路程。自改革开放以来，中国发生了翻天覆地的变化，大街上热闹非凡，公路上车水马龙，一座座高楼大厦拔地而起……中国历经千辛万苦，终于走上了繁荣富强、世界文明之路。 有一天，我偶读到《改革开放三十年》这本书，看到了祖国三十年间的巨大变化。后来，我抱着一颗期待的心向妈妈询问，妈妈回忆起过去——那时候，哪有什么柏油马路、水泥路，厚厚的泥土让人们踩成了狭窄的马路，一下雨，就泥泞不堪，路上到处是水潭，如果不小心踩到水潭，整只脚就会陷进去，好不容易把脚拔出来，可鞋子却留在了泥潭里……往事不堪回首，自从改革开放后，这一切都发生了翻天覆地的变化，泥泞小路变成了宽敞的柏油马路，路的两旁都种满了花草树木，蜜蜂在唱歌，蝴蝶在跳舞。孩子们也坐在舒适明亮的教室里上课，不再有寒冷之忧。 改革开放，使国家经济飞速发展。在短短的三十年里，中国人民渐渐地从吃不饱，穿不好变成了吃得好，穿得暖，有些人还用剩余的钱买了自行车、摩托车，甚至小汽车。 祖国日益富强起来，犹如钢铁长城一般坚不可摧！九七年香港回归，九九年澳门回归，零八年黑瞎子岛的回归使中国成为了陆地面积第二大的国家。在非典、百年不遇的南方罕见雪灾和突如其来的汶川地震面前，中华儿女们众志成城，击败了种种困难。在2001年中国荣幸地成为了二零零八年奥运会的举办国家，中华人民也成为了奥运的主人。同时，也向外国人证明了中国人不再是东亚病夫。随着科技的不断提高神八在世界人民的欢呼声中首次完成了太空行走，带着中国人盼望已久的心愿升上了天空。 三十年间，发生了无数，改变了无数，相信未来的几千、几万年间，中国还会更加飞腾！ 三十年，可谓弹指一挥间！三十年的经历会让我们触摸到社会前进的脉搏，三十年的改革开放惠及了每一个国人的生活。 三十年，对于历史长河就那么短短的一瞬间，然而，对于我们这样一个从贫穷落后一步步走向发达富裕文明和谐的国家来说，又是一个丰富而值得铭记的过程。 三十年的征程，中华民族以崭新的姿态重新屹立于世界民族之林；三十年的沧桑巨变，三十年的光辉历程，铸就了一个民族近百年的梦想！ 1978年，中共十一届三中全会做出改革开放的重大决策，由此开启了中国改革开放历史新时期。这，无疑成为中国历史的标志点，因为，是改革开放，是解放思想，实现了中国当代发展历史性的转折，中国命运由此改变，社会转型也由此开始。 2008，我们迎来改革开放30周年。中国于一九七八年走上改革开放的道路。改革开放激发了各行各业的活力，使中国的生产力不断得到发展。一个个新兴城市拔地而起。一项项重大科技成果得到制造和开发。一个个大型工程得到竣工。一个个超大型企业正在迅速成长。中国长得高了，长得壮了。改革开放是三十年来中国社会进步发展的根本动力。 改革开放的30年，是中国经济迅速蓬勃的30年！幢幢高楼拔地而起，人民生活水平不断提高，1978年到2006年间，中国经济总量迅速扩张，国内生产总值从3645亿元增长至21，0871亿元，增长近60倍！中国的经济成就不仅写在了中国历史之上，也在世界历史上刻下了辉煌的一页，过去25年全球脱贫所得成就中，近70%的成就归功于中国！中国由初级工业经济转变为高级工业经济，包括钢铁、家用电器在内的许多工业产品生产居世界第一位。与此同时，中国经济规模和经济总量也不断扩大。中国的国际地位不断提高。快速经济增长使中国在世界经济中的地位不断上升。以加入WTO为标志，中国经济已经完成市场化和国际化进程，融入世界经济体系和经济全球化浪潮之中，社会经济取得全面进步。中国的改革开放释放出巨大的生产力，政府主导、大力投资和不断强化的工业经济使中国经济增长一直高于世界经济增长水平。中国改革开放不断深入的同时，经济发展水平大幅度提高。 改革开放的30年，是中国社会和谐稳定的30年！自粉碎“四人帮”以后，中华民族犹如钢铁长城一般坚不可摧！97年香港回归，99年澳门回归；1998年面对南方历史罕见的特大洪水，2003年面对让人闻风丧胆的非典疫情，2008年面对十几个省份百年不遇的冰雪灾害，四川汶川大地震，中华儿女众志成城，手挽手将一个个磨难阻击在脚下！ 改革开放的 30年，是教育事业稳步发展的30年！中国教育发展取得长足进步。1983年，邓小平同志提出，教育要面向现代化，面对世界，面对未来！教

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为降低pro-UK的内在酶活怀,研究人员在尿激酶原cDNA的基础上,通过寡核苷酸片段置换法,构建了(Ala175→Ser175,Tyr187→His187,Lys300→His300)尿激酶原变体基因(muk8),并克隆在表达载体pKK233-2中,在Ptac启动子作用下,用IPTG诱导,在 JA221中获得表达.尿激酶原及其变体在中的表达产物基本以无活性的包含体形式存在,经体外变复性,SP-Sepharose离子交换柱层析,S-200分子筛层析,Benzamine-Sepharose吸附除去双链尿激酶,得到的蛋白为银染一条带.用人工合成的发色底物S2444测量muk8的动力学性质,它的内在酶活性比野生型pro-uk降低8倍它经纤溶酶(plasmin)激活后的双链活性比pro-UK提高50%.muk8对天然底物Glu-plg的动力学性质与它对S2444的动力学性质表现一致.

高校核酸酶检测专利论文

聚合酶链反应核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年的一天，美国科学家Kary Mulis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶中，孕育出了PCR技术的原型。他在实验上证明了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认可，Kary Mulis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段，其缺点是酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。 1988年Saiki等人从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，克服了这个缺点，从而使PCR技术得到了广泛的应用，也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。经过十几年的发展，PCR成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段，另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。因此，以PCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的应用。

1983年，美国科学家凯利·穆利斯发明了PCR(聚合酶链式反应)，这是最成熟的分子诊断，也就是核酸检测技术。实验室负责人曾宪飞教授说，核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两种。所有生物的遗传物质不是DNA就是 RNA。恰巧，新冠病毒就是RNA病毒，其遗传物质是RNA。核酸检测就是通过荧光定量PCR的方法，将基因序列扩增，扩大到几十万、几百万倍，然后通过一种荧光探针来捕捉。当扩增后的病毒浓度达到一个临界值时，就会产生荧光信号，意味着样本中被检测出携带新冠病毒的RNA。凯利·穆利斯(Kary Mullis)1944年出生于北卡罗来纳州。他在南卡罗来纳州的哥伦比亚长大，在佐治亚理工学院上大学。1973年，他在加利福尼亚大学伯克利分校获生化博士学位。穆利斯博士发明了聚合酶链式反应(PCR)，并因此于1993年获得了诺贝尔化学奖及日本奖。现在，他和妻子南希(Nancy)住在加利福尼亚州的纽波特比奇。做核酸是谁发明的穆利斯因PCR技术获得1993年诺贝尔化学奖。他还因此在1990年获美国的威廉姆·艾仑纪念奖:1991年获国家生物技术奖和《研究与进展》杂志年度科学家:在1992年获加利弗尼亚科学家年度奖:1993年获托马斯·爱迪生奖:1998年入选国家发明家名人录。他发表的论文有“时间反演的宇宙学意义”(《自然》)、“聚合酶链式反应不寻常的产生”(《科学美国人》)、“利用一种耐热DNA聚合酶，引物指导的酶促DNA反应”(《科学》)和“用聚合酶催化链反应进行体外DNA特异性扩增”(《酶学方法》)。1998年他的自传体著作《心灵裸舞》出版。穆利斯的个性独特，易于激动，可以使与他工作的人兴奋不已，对复杂问题能有巧妙的解决方法。他兴趣广泛，发表过诗歌、散文和小说，在大学期间虽然他学习化学，但发表了物理学方面的论文。他不很善于与人合作，与实验室的其他科学家多次产生磨擦。他拒绝承认PCR成功的重要原因是 PCR小组集体努力的结果。可以说，他是最先提出 PCR概念的，并坚信它具有光明前景。<

因为那个时候刚刚开始爆发，什么时候都还没有研制出来呢，大家对这个病刚开始是一无所知的，后来才开始提取病毒，然后才进行研究，才会有做核算这种的，刚开始都是做ct，后来发现做ct查不出来，然后才发明了核酸