丙肝rna论文范文

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关于丙肝论文范文资料

10%尽早治疗转为慢性不好治，因为没有疫苗生产时感染会很麻烦

现在的情况症状有哪些，可以详细的说一下，希望能帮助到你。

丙肝病毒携带者，在这种情况下要赶紧治疗的，因为丙型肝炎有70％－85％会转变为慢性丙肝、肝硬化，因此只要HCV-RNA阳性，就应该进行抗病毒治疗，庆幸的是，丙肝的治愈率很高，一般在85％左右，现在最好的治疗方法是长效干扰素（每周皮下注射1次）＋利巴韦林（口服）联合治疗，另外还要看丙肝病毒的基因型，基因1型的，需要治疗1年，基因2、3型的要治疗半年，这是最好的治疗方法了。丙肝患者时可以结婚的，但是要等病毒转阴后，并停药约6个月后才可以准备生育。另外我这里有8只长效干扰素，市场上买1270元一只，我可以买1000元，甚至还可以再便宜一点，是我的一个朋友患丙肝时买的，太多了，没用了，现在痊愈了。祝你早日康复！

我上学那会写了两篇，1丙肝得检测，治疗 传播2检验流程中得漏洞对标本的影响

丙肝检测及临床论文

�貌《局饕�诟蜗赴�懈粗疲�鸷Ω蜗赴���鸶蜗赴�难字ⅰ⒈湫浴⒒邓馈８蜗赴�邓篮螅�橹��胁欢闲薷矗�薷吹墓�叹褪歉卧嘞宋��墓�蹋�孟褚桓錾丝冢�瓷擞�虾笮纬砂毯郏��飧霭毯垡丫�晌�宋�橹�８蜗赴���啻蔚乃鹕�-坏死-修复，渐渐形成肝纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌。这就是我们所说的“肝炎三部曲”。丙型肝炎的传播途径跟乙型肝炎的传播途径相似，主要是通过输血或者血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。在了解到了什么是丙肝后，那么丙型肝炎的临床表现有哪些呢?丙型肝炎的临床症状跟一般肝炎的临床表现基本相同，有急性和慢性两种，以慢性最多见。丙肝病毒感染后，有一段潜伏期，在丙肝的潜伏期期间，症状比较轻，急性期的丙肝不容易被人发现。一旦发现时，大多数已经转为慢性丙肝。慢性丙肝常见的临床表现有乏力、纳差、厌油、恶心、肝区隐痛、黄疸等症状。其中5%～10%的慢性丙肝患者将会最终发展为肝硬化或者肝癌，比乙肝的癌变率要高很多。因此丙肝患者要重视丙肝的治疗。推荐阅读：丙肝最新治疗方法慢性丙型肝炎的治疗，目前国内外公认有效的也只有干扰素，同样应该早期治疗。临床上倾向联合用药、例如，干扰素加胸腺肽或干扰素加病毒唑片。您有任何问题都可以在线咨询专家!丙肝的传播途径主要通过四个途径：1、血液传播：输血或血制品，吸毒者共用注射器，在消毒不彻底的地方文身、拔牙等。2、母婴传播：母亲体内的丙肝病毒通过胎盘传播给胎儿或分娩时胎儿被感染。3、性接触传播。推荐阅读：丙肝会传染吗4、日常生活密切接触传播：家庭内接触可能是丙肝毒传播途径之一。接触的内容有共用梳子，共用指甲剪，共用剃须刀，共用牙刷等。感染丙肝病毒后在早期并不表现出来，只有通过一定的医学检查才能知道。常用的方法有：1.丙肝抗体检验：抗体是由于人体免疫细胞对病毒感染或疫苗所做出的反应而产生的。抗体在血液中循环而且通常终生都会存在。丙肝抗体检验就是通过检验丙肝抗体的存在，来确定之前病毒的存在，而不是检验病毒本身。2.丙肝病毒复制测试：这个测试是探测血液中丙肝病毒的实际存在情况。这是一个很灵敏的测试，可以在感染两星期内检测到病毒。

如果检查到抗HCV弱阳性，大家不要担心。第一是假阳性，第二只有关键的HCV RNA是阳性，才能说感染了丙肝。2012年1月，我肠胃不舒服，检查的时候无意被告知抗HCV弱阳性。当时不明白，后来开始有意的查资料。挺害怕，终于2013年1月14日去检查了HCV RNA。结果等待中，今天是第二天，需要等五天。过去的一年，我身体毫无异常（HCV的窗口期比较短，半年算长了）；能吃能喝。2012年年底单位体检，肝功正常(ALT和AST分别为40和33).今天又在无锡杂志网上看到一篇广东省湛江市中医院检验科周艺和陈春兰等写的临床论文。其核心意思是“ 对2007 年3 月1 日至2008 年9 月30 日6,752 例患者中121 例抗-HCV 弱阳性标本复查及H CV-RNA 定量检测, 并在3、6 个月及1 年后再作抗-HCV 及H CV- RNA 检测, 以确定感染HCV 状况。结果 121 例抗-HCV 弱阳性标本复查后，只有116 例为阳性标本, 其中H CV-RNA 阳性15 例；3 个月后第2 次复查抗-H CV 阳性只有12 例, HCV- RNA 阳性9 例; 6 个月后第3 次复查抗-HCV 阳性只有10 例, HCV-RNA 阳性8 例; 1 年后第4 次复查抗-H CV 阳性只有9 例, HCV-RNA阳性8 例。”这些临床数据表明：抗HCV弱阳性并不可怕，能够真正抗HCV和HCV RNA同时阳性的比例非常低。临床结果说得很清楚，同时阳性的人数及比例不断在下降。只有：抗HCV和HCV RNA同时阳性，才能说感染丙肝。何况，抗HCV弱阳性还不是阳性呢。2013年1月18日出本人的HCV RNA检验结果，期待是惊喜。2013年1月18日到了，拿到了报告（北京第二炮兵总医院检查的）。HCV抗体数据位，阴的不能再阴了；HCV RNA为低于1,000 - 这是下限，就是检测不出任何丙肝病毒！ 高兴，高兴，今个真高兴！

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rna结构论文

RNA称为：核糖核酸，属于核酸的一种，主要由核糖核苷酸组成，构成RNA的核糖核苷酸一共有4种，每种核糖核苷酸都是由三个部分组成：一分子磷酸、一分子核糖和一分子含氮碱基（构成核糖核苷酸的含氮碱基有四种：腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C、尿嘧啶U）。一般中学要求掌握到这么多！

DNA概述DNA即脱氧核糖核酸（英文Deoxyribonucleic acid的缩写）,又称去氧核糖核酸，是染色体的主要组成成分，同时也是组成基因的材料。有时被称为“遗传微粒”，因为在繁殖过程中，父代把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。原核细胞的染色体是一个长DNA分子。真核细胞核中有不止一个染色体，每个染色体也只含一个DNA分子。不过它们一般都比原核细胞中的DNA分子大而且和蛋白质结合在一起。DNA分子的功能是贮存决定物种性状的几乎所有蛋白质和RNA分子的全部遗传信息;编码和设计生物有机体在一定的时空中有序地转录基因和表达蛋白完成定向发育的所有程序;初步确定了生物独有的性状和个性以及和环境相互作用时所有的应激反应.除染色体DNA外，有极少量结构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。DNA病毒的遗传物质也是DNA,极少数为分子特性稳定性DNA分子的双螺旋结构是相对稳定的。这是因为在DNA分子双螺旋结构的内侧,通过氢键形成的碱基对,使两条脱氧核苷酸长链稳固地并联起来。另外,碱基对之间纵向的相互作用力也进一步加固了DNA分子的稳定性。各个碱基对之间的这种纵向的相互作用力叫做碱基堆集力,它是芳香族碱基π电子间的相互作用引起的。现在普遍认为碱基堆集力是稳定DNA结构的最重要的因素。再有,双螺旋外侧负电荷的磷酸基团同带正电荷的阳离子之间形成的离子键,可以减少双链间的静电斥力,因而对DNA双螺旋结构也有一定的稳定作用。多样性 DNA分子由于碱基对的数量不同,碱基对的排列顺序千变万化,因而构成了DNA分子的多样性。例如,一个具有4 000个碱基对的DNA分子所携带的遗传信息是4种,即10种。特异性 不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在着差异,因此,每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序,这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息,从而使DNA分子具有特异性。发现，发展DNA结构的发现是科学史上最具传奇性的“章节”之一。发现ＤＮＡ结构是划时代的成就，但发现它的方法是模型建构法，模型建构法就像小孩子拼图游戏一样的“拼凑”法。而在这场“拼凑”中表现最出色的是沃森和克里克。1928年4月6日，沃森出生于美国芝加哥。16岁就在芝加哥大学毕业，获得动物学学士学位，在生物学方面开始显露才华。22岁时取得博士学位，随后沃森来到英国剑桥大学的卡文迪什实验室，结识了早先已在这里工作的克里克，从此开始了两人传奇般的合作生涯。克里克于1916年6月8日生于英格兰的北安普敦，21岁在伦敦大学毕业。二战结束后，来到剑桥的卡文迪什实验室，克里克和沃森一样，对DNA有着浓厚的兴趣，从物理学转向研究生物学。当时人们已经知道，ＤＮＡ是一种细长的高分子化合物，由一系列脱氧核苷酸链构成，脱氧核苷酸又是由脱氧核糖、磷酸和含氮碱基组成，碱基有４种。在1951年，很多科学家对DNA的结构研究展开了一场竞赛。当时有两个著名的DNA分子研究小组，一个是以著名的物理学家威尔金斯和化学家富兰克林为首的英国皇家学院研究小组，他们主要用X射线衍射来研究DNA结构。一个是以著名化学家鲍林为首的美国加州理工大学研究小组，他们主要用模型建构法研究DNA结构，并且已经用该方法发现蛋白质a螺旋。1951年2月，威尔金斯将富兰克林拍的一张非常精美的DNA的X光衍射照片在意大利举行的生物大分子结构会议上展示，一直对DNA有浓厚兴趣的沃森看到这张图时，激动得话也说不出来，他的心怦怦直跳，根据此图他断定DNA的结构是一个螺旋体。他打定主意要制作一个DNA模型。他把这种想法告诉了他的合作者克里克，得到了克里克的认可。沃森和克里克构建DNA分子结构模型的工作始于1951年秋。他们用模型构建法，仿照著名化学家鲍林构建蛋白质α螺旋模型的方法，根据结晶学的数据，用纸和铁丝搭配脱氧核苷酸。他们构建了一个又一个模型，都被否定了。但沃森坚持认为，DNA分子可能是一种双链结构。因为自然界中的事物，很多是成双成对的，细胞中的染色体也是成对的。之后他们分别完成了以脱氧核糖和磷酸交替排列为基本骨架，碱基排在外面的双螺旋结构(如图一)，和以脱氧核糖和磷酸交替排 列为基本骨架，碱基排在内部，且同型碱基配对的双螺旋结构（如图二）。1952年，生物化学家查伽夫访问剑桥大学时向报道了他对人、猪、牛、羊、细菌和酵母等不同生物DNA进行分析的结果。查伽夫的结果表明，虽然在不同生物的DNA之间，4种脱氧核苷酸的数量和相对比例很不相同，但无论哪种物质的DNA中，都有A=T和G=C，这被称为DNA化学组成的“查伽夫法则”。1952年7月，查伽夫访问卡文迪什实验室时，向克里克详细解释了A:T=G:C=1:1的法则。之后，克里克的朋友，理论化学家格里菲斯通过计算表明，DNA的4种脱氧核苷酸中，A必须与T成键，G必须与C成键。这与查伽夫法则完成一致。随后，鲍林以前的同事多诺告诉沃森，A-T和G-C配对是靠氢键维系的。以上这些工作，就成了沃森和克里克DNA分子模型中A—T配对、G—C配对结构的基础。至此，DNA模型已经浮现。2月28日，沃森用纸板做成4种碱基的模型，将纸板粘到骨架上朝向中心配对，克里克马上指出，只有两条单链的走向相反才能使碱基完善配对，这正好与X光衍射资料一致。完整的DNA分子结构模型完成于1953年3月7日。根据这个模型，DNA分子是一个双螺旋结构，每一个螺旋单位包含10对碱基，长度为34埃（1埃=10-10米）。螺旋直径为20埃。4月15日，沃森和克里克关于该模型的第一篇论文在《自然》（Nature）杂志上发表。DNA分子双螺旋结构模型的发现，是生物学史上的一座里程碑，它为DNA复制提供了构型上的解释，使人们对DNA作为基因的物质基础不再怀疑，并且奠定了分子遗传学的基础。DNA双螺旋模型在科学上的影响是深远的。有人说沃森和克里克的诺贝尔奖是站在“巨人的脚趾”上获得的，我不这么认为，在X光衍射照片的基础上，运用鲍林研究蛋白质螺旋的方法，综合DNA化学研究方面的资料，沃森和克里克，特别是沃森，有着更宽广的眼界，从各专家处汲取所需，而得到新的综合结果，而且这种综合结果比其各部分更伟大，这是那些不能聚木为林的专家们无法领悟到的

靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体Gene silencing targeted to the rat AT1 receptors by efficient shRNAs and its screening 【Abstract】 AIM: To investigate the efficacy of short hairpin RNAs (shRNAs) to modulate the expression of rat angiotensin Ⅱ type1 (AT1) receptor gene in mammalian cells and to explore the correlations between the features of efficient shRNAs and shRNAs functionality. METHODS: We generated 4 shRNAs expression vectors targeting against rat angiotensinⅡ receptors. The shRNAs were targeted to 4 different regions of the same gene. The rat C6 glioma cells were transfected with constructed pGenesil1shRNA plasmid and scrambled plasmid. The cultured cells were collected at different phases for RTPCR and Western blot analyses. RESULTS: 24 h later, no significant reduction in AT1 mRNA levels at all treated groups could be detected. 48 h later, AT1 mRNA level of Pb treated group droped to (±)% of that in control group, and reached their lowest point after 72 h (±)%. No significant inhibition of AT1 receptor mRNA expression was found in other groups (P＞). The AT1 mRNA and protein levels behaved ultimately similarly. At hour 24 and 48, the AT1 protein was (±)% and (±)% respectively compared to control and a maximum reduction was observed after 72 h incubation 〔(± compared to controls)〕. CONCLUSION: Besides some general rules, we believe that the loop structure in the mRNA at the region targeted by siRNA and the better accessibility of the siRNA to targeted mRNA do have a strong effect on silencing. 【Keywords】 RNAi; hypertension; angiotensinⅡreceptor; vector 【摘要】 目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系. 方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤C6细胞，并在不同时相收集转染的细胞，进行RTPCR和Western blot检测. 结果：转染24 h之后，各处理组均未见AT1 mRNA水平有明显减少. 与对照组相比，Pb组在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到（±）%，72 h后达到最低点（±）%. 其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞). 抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似. 与对照组相比，Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至（±）% 和（±）%，最大减少在转染后72 h （±）%. 结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原则之外，靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用. 【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体 基因干扰（RNA interference）可以特异性地靶向降解目的基因mRNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默〔1〕. 在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤C6细胞中的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的mRNA，选取并合成了多条编码大鼠AT1R mRNA的短发夹RNA（shRNA）的核苷酸单链，退火形成双链结构并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1R shRNA的表达载体之后，转染C6细胞. 根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差别，探索筛选有效shRNA的原则. 1材料和方法 1．1材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ购自大连宝生物工程有限公司; T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs公司; 大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞购自中国典型物保藏中心; 细胞培养液DMEM购自Hyclone公司; 转染试剂Metafectamine购自德国Biotex公司. 所有的DNA合成及引物合成服务均由上海博亚生物技术有限公司提供. 1．2方法 1．2．1靶基因AT1R mRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列（序列号NM_030985），利用网上设计软件siRNA Target Finder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且GC含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对照. 将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）质粒. 1．2．2细胞培养及转染按2×108/L密度以相同的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%～60%. 用Metafectamine转染细胞，按1∶6的比例，根据试剂提供商的转染方案进行转染. 1．2．3RTPCRAT1基因引物序列为：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′, 5′CTTTGCTTGGTTACT CCTTCA3′，内参GAPDH的引物序列为：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′, 5′TTAGTGGGGTCT CGCTCC3′. 反应体积25 μL包括5 μL cDNA，各引物 μL， μL MgCl2， μL Taq DNA聚合酶， μL dNTP混合物和5 μL 10×缓冲液. 反应条件: 在94℃退火3 min之后，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s进行30个循环. 毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳. 1．2．4Western Blot分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获C6细胞. PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞. 煮沸溶解液10 min后，离心，取上清，弃沉淀物. 确定蛋白浓度. 电泳分离细胞溶解液，转膜. 50 g/L脱脂奶封闭后，加入抗AT1抗体（1∶1000）和抗βactin抗体（1∶1500）室温下孵育 h，再加入二抗（抗兔HRP抗体）孵育，增强型化学发光显色.统计学处理：根据RTPCR和Western Blot分析结果，用图像处理软件ImageTool 测灰度值，并与内参照相比得相对值. 用SPSS 统计软件oneway ANOVA进行组间方差分析. 显著性水平为P＜. 2结果 2．1不同shRNA表达质粒靶点及二级结构我们选择大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA序列的部分序列,即556~575 bp，469~488 bp，595~614 bp， 663~682 bp,做为基因沉默靶位（图1）. 构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示. 除在3′端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反义链与靶序列互补. 其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA. 所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因mRNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA则不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应. 2．2AT1shRNA转染后AT1 mRNA水平和蛋白表达转染四组阳性质粒24 h后，各组AT1 mRNA水平无明显减少. 在48 h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1 mRNA表达水平下降到（±）%，72 h下降到最低点〔仅为对照组的（±）%〕. 转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤C6细胞其AT1受体mRNA表达水平无明显抑制(P>). 结果提示，Pb质粒明显抑制了AT1受体mRNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体mRNA基因作用不显著（图3，4）. 将抑制AT1受体mRNA有效的Pb质粒进行Western Blot分析. 在24 h和48 h，AT1蛋白的表达分别为（±）% 和（±）%. 与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72 h〔仅为对照组的（±）%〕. 结果表明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白水平下降. 而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组则并不能减少AT1基因的表达（图5）. 所有的结果清楚表明，转染Pb质粒能够抑制AT1基因的表达. 3讨论 肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素Ⅱ具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用. 研究证实，血管紧张素Ⅱ参与了动脉硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程. 血管紧张素Ⅱ通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生〔2〕. 同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑〔3〕. 本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1 mRNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素Ⅱ对AT2的作用，达到血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的〔4〕. 实验结果表明，我们观测到AT1基因mRNA的表达在早期即有减少，而随着mRNA水平的抑制，相应的蛋白也有所减少. 结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达. 因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的治疗方法. 目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准〔5〕. 为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级结构及siRNA双链的序列特异性进行了研究. 普遍认为〔6〕，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进行选择，应避开起始密码子的5′或3′端非编码区选择siRNA序列. 选择的正义链序列应是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3′突出末端. 并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸. 决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在mRNA三级结构中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等〔7-8〕. 在比较本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二级结构中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RISC (RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA裂解部位而导致实验失败的原因之一. 而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二级结构中的表面位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：①质粒Pa的GC含量偏低可以导致对靶基因mRNA的识别效率的减少; ②与RISC杂交效率的下降. 除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的局部二级结构比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位. 在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中mRNA的结构是否足够松散，允许siRNA与RISC复合体进行靶向裂解. 总之，在进行短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；GC含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5′AA（N19）序列并进行BLAST等一些普遍的规则〔9〕之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级结构是否松散是有效shRNA合理设计并取得实验成功的最重要的因素. 【参考文献】 〔1〕 Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕. Nature, 1998, 391（6669）:806-811. 〔2〕 Dinh DT, Frauman AG, Johnston CI, et al. Angiotensin receptors: Distribution, signaling and function〔J〕. Clin Sci(Lond)， 2001,100(5): 481-492. 〔3〕 Levy BI. Can Angiotensin II Type 2 receptors have deleterious effects in cardiovascular disease? Implications for therapeutic blockade of the reninangiotensin system〔J〕. Circulation, 2004, 109(1): 8-13. 〔4〕 Esler M. The sympathetic system and hypertension〔J〕. Am J Hypertens Suppl, 2000, 13(6):99S-105S. 〔5〕 Wadhwa R, Kaul SC, Miyagishi M, et al. Knowhow of RNA interference and its applications in research and therapy〔J〕. Mutat Res, 2004, 567(1):71-84. 〔6〕 Miyagishi M, Hayashi M, Taira K. Comparison of the suppressive effects of antisense oligonucleotide and siRNAs directed against the same targets in mammalian cells〔J〕. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2003, 13(1): 1-7. 〔7〕 Miyagishi M, Taira K. Development and application of siRNA expression vector〔J〕. Nucleic Acids Res Suppl, 2002,(2): 113-114. 〔8〕 Hamada M, Ohtsuka T, Kawaida R, et al. Effects on RNA interference in gene expression (RNAi) in cultured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 30ends of siRNAs〔J〕. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12(5): 301-309. 〔9〕 Elbashir SM, Harborth J, Weber K, et al. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs〔J〕. Methods, 2002, 26(2): 199-213.

转运RNA：一种由76-90个核苷酸所组成的RNA

rna研究论文

靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体Gene silencing targeted to the rat AT1 receptors by efficient shRNAs and its screening 【Abstract】 AIM: To investigate the efficacy of short hairpin RNAs (shRNAs) to modulate the expression of rat angiotensin Ⅱ type1 (AT1) receptor gene in mammalian cells and to explore the correlations between the features of efficient shRNAs and shRNAs functionality. METHODS: We generated 4 shRNAs expression vectors targeting against rat angiotensinⅡ receptors. The shRNAs were targeted to 4 different regions of the same gene. The rat C6 glioma cells were transfected with constructed pGenesil1shRNA plasmid and scrambled plasmid. The cultured cells were collected at different phases for RTPCR and Western blot analyses. RESULTS: 24 h later, no significant reduction in AT1 mRNA levels at all treated groups could be detected. 48 h later, AT1 mRNA level of Pb treated group droped to (±)% of that in control group, and reached their lowest point after 72 h (±)%. No significant inhibition of AT1 receptor mRNA expression was found in other groups (P＞). The AT1 mRNA and protein levels behaved ultimately similarly. At hour 24 and 48, the AT1 protein was (±)% and (±)% respectively compared to control and a maximum reduction was observed after 72 h incubation 〔(± compared to controls)〕. CONCLUSION: Besides some general rules, we believe that the loop structure in the mRNA at the region targeted by siRNA and the better accessibility of the siRNA to targeted mRNA do have a strong effect on silencing. 【Keywords】 RNAi; hypertension; angiotensinⅡreceptor; vector 【摘要】 目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系. 方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤C6细胞，并在不同时相收集转染的细胞，进行RTPCR和Western blot检测. 结果：转染24 h之后，各处理组均未见AT1 mRNA水平有明显减少. 与对照组相比，Pb组在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到（±）%，72 h后达到最低点（±）%. 其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞). 抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似. 与对照组相比，Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至（±）% 和（±）%，最大减少在转染后72 h （±）%. 结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原则之外，靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用. 【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体 基因干扰（RNA interference）可以特异性地靶向降解目的基因mRNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默〔1〕. 在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤C6细胞中的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的mRNA，选取并合成了多条编码大鼠AT1R mRNA的短发夹RNA（shRNA）的核苷酸单链，退火形成双链结构并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1R shRNA的表达载体之后，转染C6细胞. 根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差别，探索筛选有效shRNA的原则. 1材料和方法 1．1材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ购自大连宝生物工程有限公司; T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs公司; 大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞购自中国典型物保藏中心; 细胞培养液DMEM购自Hyclone公司; 转染试剂Metafectamine购自德国Biotex公司. 所有的DNA合成及引物合成服务均由上海博亚生物技术有限公司提供. 1．2方法 1．2．1靶基因AT1R mRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列（序列号NM_030985），利用网上设计软件siRNA Target Finder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且GC含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对照. 将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）质粒. 1．2．2细胞培养及转染按2×108/L密度以相同的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%～60%. 用Metafectamine转染细胞，按1∶6的比例，根据试剂提供商的转染方案进行转染. 1．2．3RTPCRAT1基因引物序列为：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′, 5′CTTTGCTTGGTTACT CCTTCA3′，内参GAPDH的引物序列为：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′, 5′TTAGTGGGGTCT CGCTCC3′. 反应体积25 μL包括5 μL cDNA，各引物 μL， μL MgCl2， μL Taq DNA聚合酶， μL dNTP混合物和5 μL 10×缓冲液. 反应条件: 在94℃退火3 min之后，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s进行30个循环. 毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳. 1．2．4Western Blot分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获C6细胞. PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞. 煮沸溶解液10 min后，离心，取上清，弃沉淀物. 确定蛋白浓度. 电泳分离细胞溶解液，转膜. 50 g/L脱脂奶封闭后，加入抗AT1抗体（1∶1000）和抗βactin抗体（1∶1500）室温下孵育 h，再加入二抗（抗兔HRP抗体）孵育，增强型化学发光显色.统计学处理：根据RTPCR和Western Blot分析结果，用图像处理软件ImageTool 测灰度值，并与内参照相比得相对值. 用SPSS 统计软件oneway ANOVA进行组间方差分析. 显著性水平为P＜. 2结果 2．1不同shRNA表达质粒靶点及二级结构我们选择大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA序列的部分序列,即556~575 bp，469~488 bp，595~614 bp， 663~682 bp,做为基因沉默靶位（图1）. 构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示. 除在3′端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反义链与靶序列互补. 其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA. 所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因mRNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA则不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应. 2．2AT1shRNA转染后AT1 mRNA水平和蛋白表达转染四组阳性质粒24 h后，各组AT1 mRNA水平无明显减少. 在48 h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1 mRNA表达水平下降到（±）%，72 h下降到最低点〔仅为对照组的（±）%〕. 转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤C6细胞其AT1受体mRNA表达水平无明显抑制(P>). 结果提示，Pb质粒明显抑制了AT1受体mRNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体mRNA基因作用不显著（图3，4）. 将抑制AT1受体mRNA有效的Pb质粒进行Western Blot分析. 在24 h和48 h，AT1蛋白的表达分别为（±）% 和（±）%. 与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72 h〔仅为对照组的（±）%〕. 结果表明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白水平下降. 而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组则并不能减少AT1基因的表达（图5）. 所有的结果清楚表明，转染Pb质粒能够抑制AT1基因的表达. 3讨论 肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素Ⅱ具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用. 研究证实，血管紧张素Ⅱ参与了动脉硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程. 血管紧张素Ⅱ通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生〔2〕. 同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑〔3〕. 本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1 mRNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素Ⅱ对AT2的作用，达到血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的〔4〕. 实验结果表明，我们观测到AT1基因mRNA的表达在早期即有减少，而随着mRNA水平的抑制，相应的蛋白也有所减少. 结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达. 因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的治疗方法. 目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准〔5〕. 为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级结构及siRNA双链的序列特异性进行了研究. 普遍认为〔6〕，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进行选择，应避开起始密码子的5′或3′端非编码区选择siRNA序列. 选择的正义链序列应是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3′突出末端. 并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸. 决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在mRNA三级结构中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等〔7-8〕. 在比较本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二级结构中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RISC (RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA裂解部位而导致实验失败的原因之一. 而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二级结构中的表面位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：①质粒Pa的GC含量偏低可以导致对靶基因mRNA的识别效率的减少; ②与RISC杂交效率的下降. 除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的局部二级结构比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位. 在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中mRNA的结构是否足够松散，允许siRNA与RISC复合体进行靶向裂解. 总之，在进行短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；GC含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5′AA（N19）序列并进行BLAST等一些普遍的规则〔9〕之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级结构是否松散是有效shRNA合理设计并取得实验成功的最重要的因素. 【参考文献】 〔1〕 Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. 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Development and application of siRNA expression vector〔J〕. Nucleic Acids Res Suppl, 2002,(2): 113-114. 〔8〕 Hamada M, Ohtsuka T, Kawaida R, et al. Effects on RNA interference in gene expression (RNAi) in cultured mammalian cells of mismatches and the introduction of chemical modifications at the 30ends of siRNAs〔J〕. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12(5): 301-309. 〔9〕 Elbashir SM, Harborth J, Weber K, et al. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs〔J〕. Methods, 2002, 26(2): 199-213.

自己去NCBI上找 多得去了 比如下面是Nature的一篇Review