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生物制药论文5000字题目有哪些

发布时间:2024-07-06 22:47:02

生物制药论文5000字题目有哪些

海洋生物来源药物先导化合物的研究进展【摘要】海洋生物中活性物质丰富,本篇文章对国内外近3年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了归纳,并对其研究趋势进行了展望。这些新发现的萜类化合物广泛分布于海藻、珊瑚、海绵以及一些海洋真菌等海洋生物中,主要以单萜、倍半萜、二萜、三萜结构型式存在;而糖苷类化合物在海藻、海绵、海参、海星等海洋生物中发现大部分以糖苷脂、甾体糖苷、萜类糖苷型式存在。【关键词】海洋生物萜类化合物糖苷类生物活性【Abstract】MThispaperreviewsterpenoidsandglycosidesfrommarineorganismathomeandabroadsince2005,Terpenoidsaremainlyoccurredonmarinealgae,coral,spongeandsomefungibymonoterpene,sesquiterpene,Andglycosideswithstructuresoflipid,steroidandterpenoidaredistributedtomarinealgae,sponge,【Keywords】Marineorganism;terpenoid;glycoside;bioactivity海洋是生命之源,由于海洋环境的特殊性,具有高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部高温、高盐等生命极限环境,海洋生物适应了海洋独特的生活环境,必然造就了海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景,必定也会有新的、在许多陆地生物中未曾发现过的新结构类型和特殊生物活性的化合物。萜类物质是一类天然的烃类物质,其分子中具有异戊二烯(C5H8)的基本单位。故凡由异戊二烯衍生的化合物,其分子式符合(C5H8)n通式的均称萜类化合物(terpenoids)或异戊二烯类化合物(isopenoids)。但有些情况下,在分子合成过程中由于正碳离子引起的甲基迁移或碳架重排以及烷基化、降解等原因,分子的某一片断会不完全遵照异戊二烯规律产生出一些变形碳架,它们仍属于萜类化合物。海洋生物中萜类化合物主要以单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜为主,三萜和四萜种类和数量都较少,且大部分以糖苷形式存在。萜类化合物是海洋生物活性物质的重要组成部分,广泛分布于海藻、珊瑚、海绵、软体动物等海洋生物中,具有细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌止痛等活性作用。糖苷的分类有多种方法,按照在生物体内是原生的还是次生的可将其分为原生糖苷和次生糖苷(从原生糖苷中脱掉一个以上的苷称为次生苷或次级苷);按照糖苷中含有的单糖基的个数可将糖苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等;按照糖苷的某些特殊化学性质或生理活性可将糖苷分为皂苷、强心苷等;按照苷元化学结构类型可分为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、生物碱糖苷、三萜糖苷等,海洋类的糖苷大部分是按照此特点分类的,主要包括鞘脂类糖苷、甾体糖苷、萜类糖苷和大环内酯糖苷等,在很多海洋生物如海藻、珊瑚、海参、海绵等中均发现有糖苷类化合物存在。已有的研究表明海洋糖苷类成分大都具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强免疫力等生物活性。抗白血病和艾氏癌药物阿糖胞苷Ara-C(D-arabinosylcytosine)1、抗病毒药物的Ara-A2以及Ara-C的N4-C16-19饱和脂肪酰基化衍生物3是海洋糖苷类药物成功开发的典范〔1〕。本篇文章对国内外自2005年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了总结。1萜类化合物1单萜2005年MGKnott等人〔2〕对从红藻Plo

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药品生物测定的发展趋势〔摘要〕 生物测定是经典的药品检测专业之一,现代仪器分析的广泛应用,给其带来了极大的挑战和机遇,面对目前的基本状况,阐明了生物测定专业在中药开发、新药研制、药物安全性评价及微生物限度检查方面的应用和发展趋势。 〔关键词〕 生物测定;药理;药品 药品是特殊商品,药品质量直接关系到用药者的安全和疗效。药品检测方法和检测水平随着制药工业的发展不断改进提高。由于现代科学技术的发展,相邻学科之间的相互渗透,分析化学的发展经历了三次巨大的变革,使分析化学发展成为以仪器分析为主的现代分析化学。面对生命科学中复杂的分离分析任务,发展了色谱分析方法。结构分析、价态分析、晶体分析等方面的研究又促进了光谱分析的发展。以计算机应用为主要标志的信息时代的来临,仪器分析迅速发展,为药物检测提供各种非常灵敏、准确而快速的分析方法〔1〕。生物测定受到了极大的挑战,其发展前景令我们从事药品生物测定工作者所关注。 1 药品生物的特点与业务范围 1 药品生物测定的定义与特点 药品生物测定(简称生测)是利用药品(或药品中的有害杂质)对生物(或离体器官及组织)所引起的反应来测定药品的含量或安全性的一种方法。 生测法的优点是测定的结果与医疗要求基本一致,能直接反映药品的效果或毒副作用,这是其他物理学方法或化学方法所不能达到的。因此,目前各国药典仍大都采用这一方法。 生测法的缺点是检验周期长,微生物有生长繁殖过程,动物有生理代谢过程,观察分析时间一般在2~7天,有些试验会更长。影响因素多,有生物差异性,也有系统操作误差和环境条件等造成的影响。用品用具、动物质量、仪器设备都会对结果产生影响〔2〕。所以,以生测主检的品种在中国药典中逐版减少。 2 药品生物测定的业务范围 中国药典是法定的药品标准,它将药品质量控制项目归为四类:性状、鉴别、检查和含量。生测的业务主要涉及到中西药品的检查类和含量类。 其中作为药品安全性检查项目最多,包括:无菌、热原、细菌内毒素、异常毒性、安全试验、急性全身毒性、过敏物质、刺激性、溶血、降压物质、微生物限度等。含量(或效价)测定包括:抗生素微生物检定法,胰岛素、硫酸鱼精蛋白、缩宫素、卵泡刺激素、黄体生成素、升压素等生物检定法。 2 药品生物测定的现状 由于现代化检测仪器的广泛应用,药品生物测定的品种和范围,方法和要求,也发生了很大变化。 1 品种和范围的变化 抗生素的含量测定,最初大部分抗生素用微生物法测定含量。随着制药工业发展,提纯方法不断改进,有效组分更加明确,许多品种检测方法不断改为仪器测定和化学测定。例如:2000年版中国药典收载约219个抗生素品种,其中有15个原料药及其制剂从1995年版的化学法和微生物法改为高效液相色谱法(简称HPLC),使该法达到97种,微生物法仅有24个,其中9个品种是新增加的。有人预计本世纪初,HPLC法会发展成为中国药典使用频率最高的一种仪器分析法〔3〕。规定取消抗生素过期检验,抗生素微生物效价测定的业务工作量更是明显减少。 药品注射剂的热源检查。1942年美国首先将家兔法收入药典,相继世界各国药典均规定用该法。中国药典从1953年开始收载。自1973年以来,鲎试剂被证明是一种检测细菌内毒素(热原)存在的灵敏试剂。用鲎试剂要比家兔试验迅速、经济,所需样品量少,操作过程工作量小,每天可进行许多样品检测。1980年美国药典20版首载“细菌内毒素检查法”,1985年USP21版收载5种注射用水及40种放射性药品。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔法,用细菌内毒素检查法代替。1995年USP23版注射剂的热源项几乎都被细菌内毒素检查法代替〔4〕。 我国从20世纪70年代开始研究制备鲎试剂,1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法,1993年中国药典第二增补本收载该法,但未涉及任何品种,1995年中国药典二部正式收载,并规定了注射用水、氯化钠注射液和二十多种放射性药品并删除热源检查,以内毒素代替。2000年版中国药典进一步扩大到68种。预计2005年版中国药典还要继续增加品种,热源项都将被内毒素代替。动物试验改为生化试验。 2 实验动物 生测离不开实验动物,在实验中,为了减少生物差异,提高动物反应敏感性,以最少的动物达到最满意的结果。国家非常重视实验动物,1988年国务院颁布了《实验动物管理条件》,对实验动物的饲管、管理、使用等做出了明确规定,实行达标认证制度,严格管理。按微生物控制程度把实验动物分为四级:普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物和无菌动物〔5〕。一般动物实验必须达到清洁动物标准,种系清楚,不杂乱,无规定指出的疾病。动物级别越高,饲养管理条件越严,设施投资越大。实验动物是实验研究的活试剂,既要有纯度,也要有数量,背景明确,来源清楚,符合要求才能使用。(随着药品纯度的提高,凡是有准确的化学和物理方法或细胞学方法能取代动物实验,进行药品和生物制品质量检测,应尽量采用,以减少动物的使用。) 3 药品生物测定在方法上的改进与变化 为了缩短操作时间,减少实验误差,近年来生测方面也研制并投入使用了部分仪器设备,如:抗生素抑菌圈测定仪、微机热原测温仪、集菌仪、细菌数测定仪等,减轻了工作强度,提高了工作效率,检测结果更加准确可靠。 3 药品生物测定的发展趋势 生测作为经典方法沿用至今,表明它有其他方法不能替代的特点,在药品检验中发挥了重要作用。不少老产品改为其他方法控制质量,也会不断有新产品离不开生测法,我们应当充分发挥它的优点,尽量克服它的不足,开拓新的业务范围。1 微生物限度检查工作量大 为了控制药品染菌限度,1975年美国药典19版首载微生物限度检查,1980年英国药典收载,我国在1990年由卫生部颁布了药品卫生标准及检验方法,1995年版中国药典正式收载〔6〕。2000年版中国药典按剂型规定了微生物限度标准,执行范围除注射剂和中药饮片外几乎包括中西药的所有制剂和原料。该项检查成为药典品种适用最多的检查项目,占当前地市级药品检验所生测室业务工作量的80%以上。在这项检查中,有大量的业务技术需要我们进一步研究,改进试验条件,使数据准确,探讨快速检测的新方法。药包材的检查,国家药监局已经发布试行标准,业务范围将更加扩大,这是我们进一步做好工作,努力探讨研究的新领域。 2 药品生物测定在中药开发中的作用 我国是中药王国,2000年版中国药典一部共收载920种,其中中成药398种。有含量测定的157种,仅占总数的17%,中药成分多,杂质和干扰物质很多。复方制剂,尤其大复方制剂专属性的检出处方中所含药材很困难,有大量的研究工作需要做。中成药中的杂质如重金属、残留农药等达到一定水平会产生毒副作用,影响药物安全性〔7〕。要让中药制剂打进国际市场,我们在检查类的控制项目和含量类的方法探讨方面有大量工作要做,生物测定可以在毒理、药理方面进行研究、探讨,逐步完善质量控制标准,提高制剂质量发挥更大的作用。 3 新药研制开发与安全性评价 新药研制开发是多学科合作的系统工程。在获得一个具有生物活性的化合物后,研究开发组织者要在生物医学领域进行药物评价研究,首先必须组织药理学、毒理学、病理学、兽医学、遗传学、生物化学、药代动力学方面的专家进行合作研究,按药物非临床研究管理规范GLP进行管理。组织药理、毒理(包括一般毒理和特殊毒理)、病理、药代动力学和毒代动力学、药物分析、临床化学、实验动物、生物统计、质量保证等部门有关人员进行讨论,分阶段做出评价〔8〕。生测在这方面可以参加开发研究或进行技术指导。 药物动力学研究,通常需要从动物体液或组织器官匀浆中分离、鉴定和检测代谢后的原粉及其他代谢产物。但是,将服药动物按指定时间间隔处死,测定随时间变化的血药浓度,不仅动物用量大,而且常因动物个体差异无法得到可靠结果,也无法在同一动物重复实验确证。处死动物的代谢产物也只能反映被处死时的结果,无法了解药物代谢的全过程。有学者报道,采用微透析取样技术,可在活的动物不同部位重复取样,用微柱液相色谱〔9〕或毛细管电泳〔10〕进行分析,测定药物的吸收、分布、代谢和排泄情况〔11〕。 自动进取样装置和计算机工作站应用于药理实验的探讨,使药品生物测定趋向微量、灵敏、专属、简便、快速和自动化的方向发展。 综上所述,药品生物测定是药物分析的重要组成部分,是不可缺的检测专业,现代仪器的大量使用,不仅不会影响其发展,而是如虎添翼,让药品生物测定展示出新的前景。 〔参考文献〕 1 倪坤义,田颂九,丁丽霞21世纪药物分析学的发展趋势中国药学杂志,2000,35(12): 2 张治锬抗生素药品检验北京:人民卫生出版社,1991,12- 3 田颂九,丁丽霞,田洁国内外药典中质量标准的发展趋势简述中国药学杂志,1999,34(11): 4 吴伟洪鲎与鲎试验法论文汇编(三)厦门鲎试剂厂,1996, 5 施新猷医学实验动物学西安:陕西科学技术出版社,1989, 6 马绪荣,苏德模药品微生物学检验手册北京:科学出版社,2000, 7 李真,龚培力,曾繁典药物杂质及其对安全性的影响中国临床药学杂志,2001,17(6): 8 刘昌孝美国新药研究开展与药物安全性评价研究概况中国药学杂志,1999,34(11): 9 Chen AQ,Lunte CEMicrodialysis sampling coupled on-line to fast microbore liquid J Chromatogr,1995,691(1-2): 10 Qanson LACapillary electrophoresis and microdialysis:current technology and J Chromatogr B,1997,697: 11 Yang H,Wang Q,Elmquist WF,et The desin and validation of a novel intravenous microdialysis probe:application to fluconazole pharmacokinetics in the freelymoving rat Pharm Res,1997,14

药品生物测定的发展趋势 〔摘要〕 生物测定是经典的药品检测专业之一,现代仪器分析的广泛应用,给其带来了极大的挑战和机遇,面对目前的基本状况,阐明了生物测定专业在中药开发、新药研制、药物安全性评价及微生物限度检查方面的应用和发展趋势。 〔关键词〕 生物测定;药理;药品药品是特殊商品,药品质量直接关系到用药者的安全和疗效药品检测方法和检测水平随着制药工业的发展不断改进提高。由于现代科学技术的发展,相邻学科之间的相互渗透,分析化学的发展经历了三次巨大的变革,使分析化学发展成为以仪器分析为主的现代分析化学。面对生命科学中复杂的分离分析任务,发展了色谱分析方法。结构分析、价态分析、晶体分析等方面的研究又促进了光谱分析的发展。以计算机应用为主要标志的信息时代的来临,仪器分析迅速发展,为药物检测提供各种非常灵敏、准确而快速的分析方法〔1〕。生物测定受到了极大的挑战,其发展前景令我们从事药品生物测定工作者所关注。 1 药品生物的特点与业务范围 1 药品生物测定的定义与特点 药品生物测定(简称生测)是利用药品(或药品中的有害杂质)对生物(或离体器官及组织)所引起的反应来测定药品的含量或安全性的一种方法。 生测法的优点是测定的结果与医疗要求基本一致,能直接反映药品的效果或毒副作用,这是其他物理学方法或化学方法所不能达到的。因此,目前各国药典仍大都采用这一方法。生测法的缺点是检验周期长,微生物有生长繁殖过程,动物有生理代谢过程,观察分析时间一般在2~7天,有些试验会更长。影响因素多,有生物差异性,也有系统操作误差和环境条件等造成的影响。用品用具、动物质量、仪器设备都会对结果产生影响〔2〕。所以,以生测主检的品种在中国药典中逐版减少。 2 药品生物测定的业务范围 中国药典是法定的药品标准,它将药品质量控制项目归为四类:性状、鉴别、检查和含量。生测的业务主要涉及到中西药品的检查类和含量类其中作为药品安全性检查项目最多,包括:无菌、热原、细菌内毒素、异常毒性、安全试验、急性全身毒性、过敏物质、刺激性、溶血、降压物质、微生物限度等。含量(或效价)测定包括:抗生素微生物检定法,胰岛素、硫酸鱼精蛋白、缩宫素、卵泡刺激素、黄体生成素、升压素等生物检定法。 2 药品生物测定的现状由于现代化检测仪器的广泛应用,药品生物测定的品种和范围,方法和要求,也发生了很大变化。 1 品种和范围的变化 抗生素的含量测定,最初大部分抗生素用微生物法测定含量。随着制药工业发展,提纯方法不断改进,有效组分更加明确,许多品种检测方法不断改为仪器测定和化学测定。例如:2000年版中国药典收载约219个抗生素品种,其中有15个原料药及其制剂从1995年版的化学法和微生物法改为高效液相色谱法(简称HPLC),使该法达到97种,微生物法仅有24个,其中9个品种是新增加的。有人预计本世纪初,HPLC法会发展成为中国药典使用频率最高的一种仪器分析法〔3〕。规定取消抗生素过期检验,抗生素微生物效价测定的业务工作量更是明显减少药品注射剂的热源检查。1942年美国首先将家兔法收入药典,相继世界各国药典均规定用该法。中国药典从1953年开始收载。自1973年以来,鲎试剂被证明是一种检测细菌内毒素(热原)存在的灵敏试剂。用鲎试剂要比家兔试验迅速、经济,所需样品量少,操作过程工作量小,每天可进行许多样品检测。1980年美国药典20版首载“细菌内毒素检查法”,1985年USP21版收载5种注射用水及40种放射性药品。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔法,用细菌内毒素检查法代替。1995年USP23版注射剂的热源项几乎都被细菌内毒素检查法代替〔4〕。 我国从20世纪70年代开始研究制备鲎试剂,1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法,1993年中国药典第二增补本收载该法,但未涉及任何品种,1995年中国药典二部正式收载,并规定了注射用水、氯化钠注射液和二十多种放射性药品并删除热源检查,以内毒素代替。2000年版中国药典进一步扩大到68种。预计2005年版中国药典还要继续增加品种,热源项都将被内毒素代替。动物试验改为生化试验。 2 实验动物 生测离不开实验动物,在实验中,为了减少生物差异,提高动物反应敏感性,以最少的动物达到最满意的结果。国家非常重视实验动物,1988年国务院颁布了《实验动物管理条件》,对实验动物的饲管、管理、使用等做出了明确规定,实行达标认证制度,严格管理。按微生物控制程度把实验动物分为四级:普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物和无菌动物〔5〕。一般动物实验必须达到清洁动物标准,种系清楚,不杂乱,无规定指出的疾病。动物级别越高,饲养管理条件越严,设施投资越大。实验动物是实验研究的活试剂,既要有纯度,也要有数量,背景明确,来源清楚,符合要求才能使用。(随着药品纯度的提高,凡是有准确的化学和物理方法或细胞学方法能取代动物实验,进行药品和生物制品质量检测,应尽量采用,以减少动物的使用。) 3 药品生物测定在方法上的改进与变化 为了缩短操作时间,减少实验误差,近年来生测方面也研制并投入使用了部分仪器设备,如:抗生素抑菌圈测定仪、微机热原测温仪、集菌仪、细菌数测定仪等,减轻了工作强度,提高了工作效率,检测结果更加准确可靠。 3 药品生物测定的发展趋势生测作为经典方法沿用至今,表明它有其他方法不能替代的特点,在药品检验中发挥了重要作用。不少老产品改为其他方法控制质量,也会不断有新产品离不开生测法,我们应当充分发挥它的优点,尽量克服它的不足,开拓新的业务范围。 1 微生物限度检查工作量大 为了控制药品染菌限度,1975年美国药典19版首载微生物限度检查,1980年英国药典收载,我国在1990年由卫生部颁布了药品卫生标准及检验方法,1995年版中国药典正式收载〔6〕。2000年版中国药典按剂型规定了微生物限度标准,执行范围除注射剂和中药饮片外几乎包括中西药的所有制剂和原料。该项检查成为药典品种适用最多的检查项目,占当前地市级药品检验所生测室业务工作量的80%以上。在这项检查中,有大量的业务技术需要我们进一步研究,改进试验条件,使数据准确,探讨快速检测的新方法。药包材的检查,国家药监局已经发布试行标准,业务范围将更加扩大,这是我们进一步做好工作,努力探讨研究的新领域。 2 药品生物测定在中药开发中的作用 我国是中药王国,2000年版中国药典一部共收载920种,其中中成药398种。有含量测定的157种,仅占总数的17%,中药成分多,杂质和干扰物质很多。复方制剂,尤其大复方制剂专属性的检出处方中所含药材很困难,有大量的研究工作需要做。中成药中的杂质如重金属、残留农药等达到一定水平会产生毒副作用,影响药物安全性〔7〕。要让中药制剂打进国际市场,我们在检查类的控制项目和含量类的方法探讨方面有大量工作要做,生物测定可以在毒理、药理方面进行研究、探讨,逐步完善质量控制标准,提高制剂质量发挥更大的作用。 3 新药研制开发与安全性评价 新药研制开发是多学科合作的系统工程。在获得一个具有生物活性的化合物后,研究开发组织者要在生物医学领域进行药物评价研究,首先必须组织药理学、毒理学、病理学、兽医学、遗传学、生物化学、药代动力学方面的专家进行合作研究,按药物非临床研究管理规范GLP进行管理。组织药理、毒理(包括一般毒理和特殊毒理)、病理、药代动力学和毒代动力学、药物分析、临床化学、实验动物、生物统计、质量保证等部门有关人员进行讨论,分阶段做出评价〔8〕。生测在这方面可以参加开发研究或进行技术指导。 药物动力学研究,通常需要从动物体液或组织器官匀浆中分离、鉴定和检测代谢后的原粉及其他代谢产物。但是,将服药动物按指定时间间隔处死,测定随时间变化的血药浓度,不仅动物用量大,而且常因动物个体差异无法得到可靠结果,也无法在同一动物重复实验确证。处死动物的代谢产物也只能反映被处死时的结果,无法了解药物代谢的全过程。有学者报道,采用微透析取样技术,可在活的动物不同部位重复取样,用微柱液相色谱〔9〕或毛细管电泳〔10〕进行分析,测定药物的吸收、分布、代谢和排泄情况〔11〕。 自动进取样装置和计算机工作站应用于药理实验的探讨,使药品生物测定趋向微量、灵敏、专属、简便、快速和自动化的方向发展。 综上所述,药品生物测定是药物分析的重要组成部分,是不可缺的检测专业,现代仪器的大量使用,不仅不会影响其发展,而是如虎添翼,让药品生物测定展示出新的前景。

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菊科植物 菊科是比较年青而进化程度较高的一个大科。虽然出现在地球上的时间较晚,但由于该科植物在形态结构上先进,对环境适应能力强,使这个年青的科在较短的时间内,不论在种的数量上还是分布范围上,均跃居世界种子植物之冠。许多植物分类专家和系统演化专家都一致认为它在被子植物(尤其是双子叶植物)系统演化中的地位,发展到了最高阶段。菊科植物的绝大部分属、种的营养体都是草本,木本者甚少,仅占本科植物种数的5%。从进化角度看,草本植物以种子或地下器官(根、根茎、块茎、球茎等)度过环境的不良时期,比木本植物适应性强,因而较木本植物进化。菊科植物除少数种类(如百日草、鬼针草)为对生叶外,多为互生单叶。1.菊科植物繁殖器官的特点是头状花序。头状花序是由许多无柄小花(或仅有一朵花)密集着生于花序轴的顶部,聚成头状。外形酷似一朵大花,实为由多花(或一朵)组成的花序。一般再由许多头状花序组成圆锥花序、伞房花序等。漏芦属的头状花序小,只包含一朵花,由许多小的头状花序又组成较大的复头状花序。头状花序的最外面,包有总苞,一般为绿色,叶状,它的功能无疑是在头状花序未开放之前,包在外面起保护作用。但本科中许多属、种的总苞,特化成具有特殊用途的器官,如蜡菊的总苞变成膜质,并有鲜艳的色彩,用它吸引昆虫;牛蒡、苍术及苍耳等的总苞变成钩刺,腺梗菊、豨莶等的总苞上具粘质的腺毛,可利用动物来传播果实、种子。由许多小花集成头状花序,这就使本来不太明显的每个小花集在一起,显得较大而醒目,尤其当某些属、种花序边缘的舌状花开放后,使花序变得更大、更醒目,以利于招引更多的昆虫。有些属、种的头状花序中,各小花之间有了明确的分工,如向日葵,花序边缘的舌状花是不能结实的无性花,中间的管状花既能产生花粉,又能结果实,是两性花,而金盏菊与之不同,边缘的舌状花是能结实的雌花,而中间的管状花全是只能产花粉而不能结实的雄花。2.头状花序上每朵花的结构,简要概括有如下几点:萼片变成冠毛,花瓣5枚连合,雄蕊聚药、子房2心皮下位。但各属、种之间差异很大,简化或特化现象很普遍。萼片:萼片是保护器官,尤其在花蕾时期。菊科的头状花序外围有总苞统一保护,所以萼片失去了它原有的作用,有些种类特化成为果实顶端刺状、毛状或片状的“冠毛”,成为果实种子的传播器官,如蒲公英、鸦葱等具毛状冠毛,可借风力使果实到处飘扬。又如鬼针草,冠毛变成刺状,可使果实附着于动物身体上,借以传播。花瓣:5枚,互相连合成管状或舌状。从进化角度看,合瓣花是后出性状,要比离瓣花进化。若花瓣的基部连合成较长的管,顶端五个花瓣呈辐射对称排列的,叫管状花,如向日葵花序中央的小花。若花瓣基部连合成较短的管,五个花瓣连合成为片状,两侧对称,向一侧伸展的叫作舌状花,花瓣顶端五个齿,表明该舌状花是由五枚花瓣连合而成。如蒲公英的花。有的种类花瓣基部连合成较长的管,但花瓣五枚形成唇形,分上下二唇,往往有的只发育一个唇,另一个唇退化,形成假舌状花,如金盏菊和向日葵花序外围的小花。在花冠管的基部,有环形的蜜腺,可分泌花蜜贮存在管的基部。雄蕊:5枚,花丝互相分离而花药边缘互相连合形成空筒形,即聚药雄蕊。每当花药成熟时,将花粉粒撒在聚药雄蕊的“筒”中,待雌蕊花柱生长时,将它们“推”出筒外。有些种类花药的基部特化成“尾”状,其功用是保护花瓣管基部的蜜腺和花蜜,免遭灰尘或雨水的侵蚀。在每个花药的顶端有突出的“药隔”,在雄蕊未成熟时,此五个药隔互相靠合形成一个“盖子”,封住花药管的口部,起防护作用。雌蕊:子房下位,二心皮构成,一室,一枚倒生胚珠,基底着生。花柱一条,伸于花药管中,顶端柱头2裂,但在雌蕊尚未成熟时,柱头不张开。在花柱上部,常生有一圈毛,叫“扫粉毛”,每当花柱发育而伸长的过程中,此“扫粉毛”即可将雄蕊花药“撒”在花药管中的花粉粒“推”出,便于来访的昆虫携带。菊科植物花一般都是雄蕊先熟,花柱伸长过程中将花粉粒“推”出后,顶端的柱头再张开来接受其它花传来的花粉。这是避免自花传粉的适应。但是,一旦柱头上没接受到其他花传来的花粉,即异花传粉遭到失败,也无妨,柱头可以下弯,将“授粉面”接触到自己的花柱上,沾上自花产生的花粉粒,完成自花授粉。3.菊科的果实是不开裂的干果,果皮致密,其中只含有一粒种子,一般认为是瘦果。但它来源于二心皮,并且是子房下位形成的,这与由一心皮形成的子房上位的瘦果有所不同,严格说起来应叫“菊果”或“连萼瘦果”(Cypsela)。菊科植物大多数花序较大而鲜艳,适于虫媒传粉,但另外有些属、种的花并不鲜艳,例如蒿属(Artemisia)、苍耳属(Xanthium)及豚草属(Ambrosia)等,它们的花序很小,黄绿色,很不鲜艳。这些植物是由虫媒特化成风媒的一个类型。苍耳属植物是雌雄同株,异花,雄花序较小,还保留扁平的头状花序,花期很短,花谢后即脱落,往往不被人们注意到。雌花序(即所谓的“苍子”)的花序轴(托)木质化,外有许多钩刺,其中包有两朵雌花,每朵雌花只剩下一个子房和二裂的花柱,成熟时整个花序脱落。向日葵在我国各地广为种植,取材容易,而且花序及花都较大,便于观察,下面将它的各部器官作一简述,供教学参考。向日葵是原产北美洲的一年生大型草本油料作物,种子含油量9~52%。高2~4米,大型的心脏形叶,互生。头状花序单生于茎顶,一般直径30厘米,大的可达60厘米。头状花序的花序轴(托)扁平,其中充满白色海绵状的填充物(薄壁细胞)。花序边缘围有3~4层绿色的总苞。最外圈的花为鲜黄色的“舌状花”(边花),中央为黄褐色的管状花(盘花)。舌状花(边花)(见图c)是不育性的无性花,功能就是吸引昆虫来访,帮助传粉。花瓣基部连合成短管,花瓣上部扁平、伸展,由三枚花瓣连合而成,另外两枚花瓣退化,所以有人称它为“假舌状花”。子房三角柱状,内无胚珠,花柱和雄蕊皆退化,不复存在。萼片退化成膜质的“冠毛”,一般三枚,分别着生在子房三个角的顶端。子房基部无明显的苞片。管状花(盘花)(见图B)的五枚花瓣基部连合成管状,上部五个齿,辐射对称。在花瓣管的下部膨大成球形,上生纤毛,其作用有二:1.膨大的空腔内贮花蜜供来访的昆虫采食。2.膨大的部分彼此靠得紧密,填充了花冠管之间的空隙,防止雨水、灰尘或长吻昆虫伤害下面的子房。萼片退化成膜质三角形的小薄片,着生在扁平子房的两个上角,已无明显的作用,果实成熟时脱落。雄蕊的花药黑褐色,连合成管,药隔三角形,黄褐色。雌蕊的子房下位,未成熟时白色,壁薄而软,待成熟后,果皮变硬而具黑色花纹。每个子房的基部都有一枚膜质的苞片包住子房,白色,顶端有三个裂齿,当果实成熟脱落时,此苞片仍存留在扁平的花序轴上。菊科植物依据头状花序内花的形态及乳汁的有无可分为两个亚科12个族。划分标准即:管状花亚科(Asteroideae)植物体不含乳汁,头状花序皆为管状花或至少花序中的盘花为管状花。包括11个族,大多数菊科植物都属于此亚科。应当说明的是我们日常栽培的菊花(Dendranthemamorifolium)虽花序中央的盘花似舌状,那是长期人工选择的结果,它无乳汁应归于本亚科。蒿属、向日葵等,也都属于本亚科。舌状花亚科(Cichorioideae)植物体含乳汁,头状花序上皆为舌状花。只包含一个族。蒲公英、莴苣、苣荬菜等都属于本亚科。菊科植物与人类生活关系较为密切。其中有许多著名的观赏花卉如菊花、大丽菊、万寿菊、金盏菊、翠菊、蜡菊、大波斯菊(秋英)、瓜叶菊、雏菊等。日常食用的蔬菜有莴苣、茼蒿(北京称蒿子秆),菊芋(姜不辣),生菜等。药用种类较多如除虫菊、红花、牛蒡、蛔蒿(花序中产驱蛔虫有效成分——山道年)、苍术、泽兰、大蓟等。可提取芳香油的植物有艾纳香(Blumeabalsamifera),蒸馏后提取的挥发性物质即冰片,黄花蒿(Artemisiaannua)全草可提取芳香油。橡胶草(Taraxacumkok-saghyz)是北方较寒冷地区的草本橡胶资源植物,苏联曾大量栽培。对人类生活有害的植物如蒿属某些种,专门生长在农田中,是庄稼的大敌。豚草属一些种的花粉对某些人易产生过敏反应。

、我国每年的“禁毒宣传月”从6月3日开始,这是因为历史上的这一天一位著名的民族英雄开始领导人民销毁收缴的鸦片,取得了禁烟斗争的伟大胜利,这位民族英雄是

药品生物测定的发展趋势〔摘要〕 生物测定是经典的药品检测专业之一,现代仪器分析的广泛应用,给其带来了极大的挑战和机遇,面对目前的基本状况,阐明了生物测定专业在中药开发、新药研制、药物安全性评价及微生物限度检查方面的应用和发展趋势。 〔关键词〕 生物测定;药理;药品 药品是特殊商品,药品质量直接关系到用药者的安全和疗效。药品检测方法和检测水平随着制药工业的发展不断改进提高。由于现代科学技术的发展,相邻学科之间的相互渗透,分析化学的发展经历了三次巨大的变革,使分析化学发展成为以仪器分析为主的现代分析化学。面对生命科学中复杂的分离分析任务,发展了色谱分析方法。结构分析、价态分析、晶体分析等方面的研究又促进了光谱分析的发展。以计算机应用为主要标志的信息时代的来临,仪器分析迅速发展,为药物检测提供各种非常灵敏、准确而快速的分析方法〔1〕。生物测定受到了极大的挑战,其发展前景令我们从事药品生物测定工作者所关注。 1 药品生物的特点与业务范围 1 药品生物测定的定义与特点 药品生物测定(简称生测)是利用药品(或药品中的有害杂质)对生物(或离体器官及组织)所引起的反应来测定药品的含量或安全性的一种方法。 生测法的优点是测定的结果与医疗要求基本一致,能直接反映药品的效果或毒副作用,这是其他物理学方法或化学方法所不能达到的。因此,目前各国药典仍大都采用这一方法。 生测法的缺点是检验周期长,微生物有生长繁殖过程,动物有生理代谢过程,观察分析时间一般在2~7天,有些试验会更长。影响因素多,有生物差异性,也有系统操作误差和环境条件等造成的影响。用品用具、动物质量、仪器设备都会对结果产生影响〔2〕。所以,以生测主检的品种在中国药典中逐版减少。 2 药品生物测定的业务范围 中国药典是法定的药品标准,它将药品质量控制项目归为四类:性状、鉴别、检查和含量。生测的业务主要涉及到中西药品的检查类和含量类。 其中作为药品安全性检查项目最多,包括:无菌、热原、细菌内毒素、异常毒性、安全试验、急性全身毒性、过敏物质、刺激性、溶血、降压物质、微生物限度等。含量(或效价)测定包括:抗生素微生物检定法,胰岛素、硫酸鱼精蛋白、缩宫素、卵泡刺激素、黄体生成素、升压素等生物检定法。 2 药品生物测定的现状 由于现代化检测仪器的广泛应用,药品生物测定的品种和范围,方法和要求,也发生了很大变化。 1 品种和范围的变化 抗生素的含量测定,最初大部分抗生素用微生物法测定含量。随着制药工业发展,提纯方法不断改进,有效组分更加明确,许多品种检测方法不断改为仪器测定和化学测定。例如:2000年版中国药典收载约219个抗生素品种,其中有15个原料药及其制剂从1995年版的化学法和微生物法改为高效液相色谱法(简称HPLC),使该法达到97种,微生物法仅有24个,其中9个品种是新增加的。有人预计本世纪初,HPLC法会发展成为中国药典使用频率最高的一种仪器分析法〔3〕。规定取消抗生素过期检验,抗生素微生物效价测定的业务工作量更是明显减少。 药品注射剂的热源检查。1942年美国首先将家兔法收入药典,相继世界各国药典均规定用该法。中国药典从1953年开始收载。自1973年以来,鲎试剂被证明是一种检测细菌内毒素(热原)存在的灵敏试剂。用鲎试剂要比家兔试验迅速、经济,所需样品量少,操作过程工作量小,每天可进行许多样品检测。1980年美国药典20版首载“细菌内毒素检查法”,1985年USP21版收载5种注射用水及40种放射性药品。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔法,用细菌内毒素检查法代替。1995年USP23版注射剂的热源项几乎都被细菌内毒素检查法代替〔4〕。 我国从20世纪70年代开始研究制备鲎试剂,1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法,1993年中国药典第二增补本收载该法,但未涉及任何品种,1995年中国药典二部正式收载,并规定了注射用水、氯化钠注射液和二十多种放射性药品并删除热源检查,以内毒素代替。2000年版中国药典进一步扩大到68种。预计2005年版中国药典还要继续增加品种,热源项都将被内毒素代替。动物试验改为生化试验。 2 实验动物 生测离不开实验动物,在实验中,为了减少生物差异,提高动物反应敏感性,以最少的动物达到最满意的结果。国家非常重视实验动物,1988年国务院颁布了《实验动物管理条件》,对实验动物的饲管、管理、使用等做出了明确规定,实行达标认证制度,严格管理。按微生物控制程度把实验动物分为四级:普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物和无菌动物〔5〕。一般动物实验必须达到清洁动物标准,种系清楚,不杂乱,无规定指出的疾病。动物级别越高,饲养管理条件越严,设施投资越大。实验动物是实验研究的活试剂,既要有纯度,也要有数量,背景明确,来源清楚,符合要求才能使用。(随着药品纯度的提高,凡是有准确的化学和物理方法或细胞学方法能取代动物实验,进行药品和生物制品质量检测,应尽量采用,以减少动物的使用。) 3 药品生物测定在方法上的改进与变化 为了缩短操作时间,减少实验误差,近年来生测方面也研制并投入使用了部分仪器设备,如:抗生素抑菌圈测定仪、微机热原测温仪、集菌仪、细菌数测定仪等,减轻了工作强度,提高了工作效率,检测结果更加准确可靠。 3 药品生物测定的发展趋势 生测作为经典方法沿用至今,表明它有其他方法不能替代的特点,在药品检验中发挥了重要作用。不少老产品改为其他方法控制质量,也会不断有新产品离不开生测法,我们应当充分发挥它的优点,尽量克服它的不足,开拓新的业务范围。1 微生物限度检查工作量大 为了控制药品染菌限度,1975年美国药典19版首载微生物限度检查,1980年英国药典收载,我国在1990年由卫生部颁布了药品卫生标准及检验方法,1995年版中国药典正式收载〔6〕。2000年版中国药典按剂型规定了微生物限度标准,执行范围除注射剂和中药饮片外几乎包括中西药的所有制剂和原料。该项检查成为药典品种适用最多的检查项目,占当前地市级药品检验所生测室业务工作量的80%以上。在这项检查中,有大量的业务技术需要我们进一步研究,改进试验条件,使数据准确,探讨快速检测的新方法。药包材的检查,国家药监局已经发布试行标准,业务范围将更加扩大,这是我们进一步做好工作,努力探讨研究的新领域。 2 药品生物测定在中药开发中的作用 我国是中药王国,2000年版中国药典一部共收载920种,其中中成药398种。有含量测定的157种,仅占总数的17%,中药成分多,杂质和干扰物质很多。复方制剂,尤其大复方制剂专属性的检出处方中所含药材很困难,有大量的研究工作需要做。中成药中的杂质如重金属、残留农药等达到一定水平会产生毒副作用,影响药物安全性〔7〕。要让中药制剂打进国际市场,我们在检查类的控制项目和含量类的方法探讨方面有大量工作要做,生物测定可以在毒理、药理方面进行研究、探讨,逐步完善质量控制标准,提高制剂质量发挥更大的作用。 3 新药研制开发与安全性评价 新药研制开发是多学科合作的系统工程。在获得一个具有生物活性的化合物后,研究开发组织者要在生物医学领域进行药物评价研究,首先必须组织药理学、毒理学、病理学、兽医学、遗传学、生物化学、药代动力学方面的专家进行合作研究,按药物非临床研究管理规范GLP进行管理。组织药理、毒理(包括一般毒理和特殊毒理)、病理、药代动力学和毒代动力学、药物分析、临床化学、实验动物、生物统计、质量保证等部门有关人员进行讨论,分阶段做出评价〔8〕。生测在这方面可以参加开发研究或进行技术指导。 药物动力学研究,通常需要从动物体液或组织器官匀浆中分离、鉴定和检测代谢后的原粉及其他代谢产物。但是,将服药动物按指定时间间隔处死,测定随时间变化的血药浓度,不仅动物用量大,而且常因动物个体差异无法得到可靠结果,也无法在同一动物重复实验确证。处死动物的代谢产物也只能反映被处死时的结果,无法了解药物代谢的全过程。有学者报道,采用微透析取样技术,可在活的动物不同部位重复取样,用微柱液相色谱〔9〕或毛细管电泳〔10〕进行分析,测定药物的吸收、分布、代谢和排泄情况〔11〕。 自动进取样装置和计算机工作站应用于药理实验的探讨,使药品生物测定趋向微量、灵敏、专属、简便、快速和自动化的方向发展。 综上所述,药品生物测定是药物分析的重要组成部分,是不可缺的检测专业,现代仪器的大量使用,不仅不会影响其发展,而是如虎添翼,让药品生物测定展示出新的前景。 〔参考文献〕 1 倪坤义,田颂九,丁丽霞21世纪药物分析学的发展趋势中国药学杂志,2000,35(12): 2 张治锬抗生素药品检验北京:人民卫生出版社,1991,12- 3 田颂九,丁丽霞,田洁国内外药典中质量标准的发展趋势简述中国药学杂志,1999,34(11): 4 吴伟洪鲎与鲎试验法论文汇编(三)厦门鲎试剂厂,1996, 5 施新猷医学实验动物学西安:陕西科学技术出版社,1989, 6 马绪荣,苏德模药品微生物学检验手册北京:科学出版社,2000, 7 李真,龚培力,曾繁典药物杂质及其对安全性的影响中国临床药学杂志,2001,17(6): 8 刘昌孝美国新药研究开展与药物安全性评价研究概况中国药学杂志,1999,34(11): 9 Chen AQ,Lunte CEMicrodialysis sampling coupled on-line to fast microbore liquid J Chromatogr,1995,691(1-2): 10 Qanson LACapillary electrophoresis and microdialysis:current technology and J Chromatogr B,1997,697: 11 Yang H,Wang Q,Elmquist WF,et The desin and validation of a novel intravenous microdialysis probe:application to fluconazole pharmacokinetics in the freelymoving rat Pharm Res,1997,14

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生物制药我能比较多顺

液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 下载带有 Google 工具栏的 Firefox, 上网冲浪更惬意 作者; 姜维,方晓明,唐毅锋,庞国芳 【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法。方法 色谱柱:Kromasil C18(250mm×6mm,5μm);流动相:乙腈-水(65:35);流速:0ml/min;柱温:35℃;检测波长:292nm;进样量:40μl。结果 样品的室内加标平均回收率为7%~8%,室内相对标准偏差为5%~0%,室间加标平均回收率为4%~0%,室间相对标准偏差7%~1%,定量测定低限(LOQ)为10μg/kg。结论 本方法简便,准确,可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留含量的测定。 【关键词】 高效液相色谱法;脂肪;醋酸美仑孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮 Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC 【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate,chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and Methods Chromatographic separation was carried out on a C18column(250mm×6mm,5μm)and acetonitrile-water (65:35) as the mobile The flow rate was 0ml/min; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μResults The intra-laboratory average recoveries ranged from 7%~8% and RSD of 5%~0%The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 4%~0% and RSD of 7%~1%The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/Conclusion The method is simple and It is suitable for the determination of melengestrol acetate,chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and 【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物,有明显的孕激素和抗雄激素作用,可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用,动物实验表明有死胎率增加和致畸作用,副作用有:(1)恶心、头晕、倦怠;(2)突破性出血;(3)孕期服用,会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能,可以很快产生显著和直接的经济效益,因此,对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史,但人类长期食用含有激素的肉制食品,即使含量甚微,亦会明显影响机体的激素平衡,而且有致癌危险,对幼儿造成发育异常等危害。因此,开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。 检测孕激素类药物的方法有很多,如液相色谱/质谱法(LC/MS)〔1〕、气相色谱/质谱法(GC/MS)〔2,3〕和液相色谱法〔4~6〕等。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测。 1 试剂与仪器 1 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品(Sigama公司),乙腈(HPLC级),甲醇(HPLC级),乙酸乙酯(HPLC级),其他试剂为分析纯。水由Milli-Q净化系统(Millipore公司)制得。 (1)标准储备液:1000μg/ml,分别准确称取050g醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用一年。 (2)混合中间溶液I:100μg/ml,分别吸取0ml醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用一年。 (3)混合中间溶液II:0μg/ml,取00ml混合中间溶液I于100ml容量瓶中,用甲醇定容。于4℃保存,可使用半年。 (4)混合标准工作液:分别吸取10、20、40、80、100μl混合中间溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水(65:35)中,再加入10μl 2%盐酸溶液,混匀,得到浓度为010μg/ml、020μg/ml、040μg/ml、080μg/ml和10μg/ml混合标准工作液,供液相色谱测定,当日使用。 2 仪器 Waters液相色谱系统,510泵体,486紫外-可见光检测器,Emprower pro色谱软件。氮气吹干仪(Organomation Associates,J公司);固相萃取装置(Supelco公司);低温离心机(德国Eppendorf公司);涡旋混匀器(XW-80A型,上海医大仪器厂);CN固相萃取柱(3ml,Waters公司)。 2 测定步骤 1 试样的制备与保存 1 试样的制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块,然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中,放入150ml的烧杯中,将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量,使用最大功率,加热30~60s,如果脂肪没有融化,可在间隔30~60s以后重复加热30~60s,直到有液体脂肪流出,通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中,密封,并做上标记。 2 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中,冷冻保存。 2 提取 称取熬制好的脂肪油00±01g,置于50ml具塞离心管中,加入5ml乙腈,于60℃水浴中保温3min以使固体脂肪溶化,涡旋振摇1min,在-5℃下离心7min(离心力1160g),吸取上清液至15ml带塞聚丙烯离心管,再在沉淀物中加入5ml乙腈重复提取一次,合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷,涡旋振摇1min,于-5℃中离心5min(离心力1160g),弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮气吹干仪吹干,残渣待皂化。 3 皂化 在残渣(2项)中依次加入4ml正己烷、1ml 1mol/L 氢氧化钠溶液和0mol/L氯化镁溶液,于涡旋混匀器上快速混匀10s,在60℃水浴中保温15min,于-5℃中离心5min(离心力1160g),吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混匀后,在60℃水浴中加热15min后,在-5℃中离心5min(离心力1160g),合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干,用0ml正己烷溶解残渣,待净化。 4 净化 将皂化后的样液(3项)倒入经5ml乙酸乙酯和6ml正己烷预处理过的CN柱中,用2×1ml正己烷润洗玻璃试管,洗液倒入到CN柱中。待样液流过后,依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子,随后打开真空泵将小柱中液体抽干,保持抽气2min。最后用5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱,洗脱液收集于15ml玻璃试管中,于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl乙腈-水(65:35)涡旋溶解,静止15min后,加入10μl 2%盐酸溶液,混匀,供液相色谱测定。 5 测定 1 液相色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(250mm×6mm,5μm);预柱:C18柱(5mm×6mm,5μm);流动相:乙腈-水(65:35);流速:0ml/min;柱温:35℃;检测波长:292nm;进样量:40μl。 2 液相色谱测定 根据样液中3种孕酮的含量情况,选定浓度相近的标准工作液,标准工作液和样液中3种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下,标准品的色谱图见图1。 图1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图(100ng/ml)1-醋酸甲地孕酮,2-醋酸氯地孕酮,3-醋酸美仑孕酮 液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 来自: 免费论文网 3 结果与讨论 1 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在010~10μg/ml范围内,峰面积与浓度呈良好的线性关系,其相关系数(γ2)均大于998。 2 回收率、精密度和定量检测限 本实验以2种脂肪(牛脂肪和猪脂肪)作为样本。取适量标准品加入到0g样品中,使添加量相当于10、20和50μg/kg,每个添加水平各取24份试样(每种脂肪各12份)。图2为空白脂肪样品和添加样品(10μg/kg)的色谱图。表1为醋酸美仑孕酮,醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2为8家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验,能可靠测得的最低浓度确定定量检测限(LOQ),LOQ为10μg/kg,满足残留限量的检测要求。 (A) (B) (C) (D) 图2 空白脂肪样品和添加样品(10g/kg)的色谱图A:牛脂肪空白样;B:猪脂肪空白样;C:牛脂肪添加样;D:猪脂肪添加样 表1 室内回收率和精确度的结果 (每一添加量,n=24) 表2 8家实验室室间回收率和精确度的结果 (每一添加量,n=32) 【参考文献】 1 Hooijerink H,van Bennekom EO,Nielen MWFScreening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass Anal Chim Acta,2003,483(1-2): 51- 2 Neidert EE,Gedir RG,Milward LJ,et Determination and qualitative confirmation of melengestrol acetate residues in beef fat by electron-capture gas chromatography and gas-chromatographic chemical-ionization mass J Agric Food Chem,1990,38(4): 979- 3 Impens S,Courtheyn D,de Wasch K,et Faster analysis of anabolic steroids in kidney fat by downscaling the sample size and using gas chromatography-tandem mass Anal Chim Acta,2003,483(1-2): 269- 4 Gaver RC,Movahhed HS,Farmen RH,et Liquidchromatography procedure for the quantitative analysis of megestrol acetate in human J Pharm Sci,1985,74(6): 664- 5 Overdiek JWPM,Hermens WAJJ,Merkus FWHMDetermination of the serum concentration of spironolactone and its metabolites by high-performance liquid J Chromatogr B,1985,42(2): 279- 6 Campbell HM,Sauve FLiquidchromatographic determination of melengestrol acetate in J AOAC Int,1993,76(6): 1163- 液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量 来自: 思想汇报网参考资料:sixiang-

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按研究的学科,可将学术论文分为自然科学论文和社会科学论文。每类又可按各自的门类分下去。如社会科学论文,又可细分为文学、历史、哲学、教育、政治等学科论文。按研究的内容,可将学术论文分为理论研究论文和应用研究论文。理论研究,重在对各学科的基本概念和基本原理的研究;应用研究,侧重于如何将各学科的知识转化为专业技术和生产技术,直接服务于社会。按写作目的,可将学术论文分为交流性论文和考核性论文。交流性论文,目的只在于专业工作者进行学术探讨,发表各家之言,以显示各们学科发展的新态势;考核性论文,目的在于检验学术水平,成为有关专业人员升迁晋级的重要依据。科学技术报告是描述一项科学技术研究的结果或进展或一项技术研制试验和评价的结果;或是论述某项科学技术问题的现状和发展的文件。科学技术报告是为了呈送科学技术工作主管机构或科学基金会等组织或主持研究的人等。科学技术报告中一般应该提供系统的或按工作进程的充分信息,可以包括正反两方面的结果和经验,以便有关人员和读者判断和评价,以及对报告中的结论和建议提出修正意见。

海洋生物来源药物先导化合物的研究进展【摘要】 海洋生物中活性物质丰富,本篇文章对国内外近3年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了归纳,并对其研究趋势进行了展望。这些新发现的萜类化合物广泛分布于海藻、珊瑚、海绵以及一些海洋真菌等海洋生物中,主要以单萜、倍半萜、二萜、三萜结构型式存在;而糖苷类化合物在海藻、海绵、海参、海星等海洋生物中发现大部分以糖苷脂、甾体糖苷、萜类糖苷型式存在。 【关键词】 海洋生物 萜类化合物 糖苷类 生物活性 【Abstract】 Marine organism show some important biological This paper reviews terpenoids and glycosides from marine organism at home and abroad since 2005, and provides scientific evidence for reasonable exploitation and Terpenoids are mainly occurred on marine algae, coral, sponge and some fungi by monoterpene, sesquiterpene, diterpene and And glycosides with structures of lipid, steroid and terpenoid are distributed to marine algae, sponge, sea cucumber and 【Key words】 Marine organism; terpenoid; glycoside; bioactivity 海洋是生命之源,由于海洋环境的特殊性,具有高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部高温、高盐等生命极限环境,海洋生物适应了海洋独特的生活环境,必然造就了海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景,必定也会有新的、在许多陆地生物中未曾发现过的新结构类型和特殊生物活性的化合物。 萜类物质是一类天然的烃类物质,其分子中具有异戊二烯(C5H8)的基本单位。故凡由异戊二烯衍生的化合物,其分子式符合(C5H8)n通式的均称萜类化合物(terpenoids)或异戊二烯类化合物(isopenoids)。但有些情况下,在分子合成过程中由于正碳离子引起的甲基迁移或碳架重排以及烷基化、降解等原因,分子的某一片断会不完全遵照异戊二烯规律产生出一些变形碳架,它们仍属于萜类化合物。海洋生物中萜类化合物主要以单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜为主,三萜和四萜种类和数量都较少,且大部分以糖苷形式存在。萜类化合物是海洋生物活性物质的重要组成部分,广泛分布于海藻、珊瑚、海绵、软体动物等海洋生物中,具有细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌止痛等活性作用。 糖苷的分类有多种方法,按照在生物体内是原生的还是次生的可将其分为原生糖苷和次生糖苷(从原生糖苷中脱掉一个以上的苷称为次生苷或次级苷);按照糖苷中含有的单糖基的个数可将糖苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等;按照糖苷的某些特殊化学性质或生理活性可将糖苷分为皂苷、强心苷等;按照苷元化学结构类型可分为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、生物碱糖苷、三萜糖苷等,海洋类的糖苷大部分是按照此特点分类的,主要包括鞘脂类糖苷、甾体糖苷、萜类糖苷和大环内酯糖苷等,在很多海洋生物如海藻、珊瑚、海参、海绵等中均发现有糖苷类化合物存在。已有的研究表明海洋糖苷类成分大都具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强免疫力等生物活性。抗白血病和艾氏癌药物阿糖胞苷Ara-C(D-arabinosyl cytosine) 1、抗病毒药物的Ara - A 2以及Ara-C的N4-C16-19饱和脂肪酰基化衍生物3是海洋糖苷类药物成功开发的典范〔1〕。 本篇文章对国内外自2005年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了总结。 1 萜类化合物 1 单萜 2005年M G Knott等人〔2〕对从红藻Plocamium corallorhiza中分离得到的三种多卤代单萜化合物plocoralides A-C(1~3)〔3,4〕进行了活性研究,发现化合物Plocaralides B(2), C(3)对食管癌细胞WHCOI具有中等强度的细胞毒作用,这些化合物具有卤素取代基。 2 倍半萜 从海泥来源的真菌Emericella variecolor GF10的发酵液中分离得到两个新型的倍半萜化合物6-epi-ophiobolin G(4)和6-epi-ophiobolin N(5),化合物在1~3μM浓度时能使神经癌细胞Neuro 2A凋亡,同时伴随细胞萎缩和染色体聚集〔5〕。这一类ophiobolins是天然的三环或四环的倍半萜化合物,对线虫、真菌、细菌以及肿瘤细胞有着普遍的抑制活性。 Willam Fenical等人从海洋沉积物分离得到一株放线菌CNH-099,在该菌的代谢产物中分离到具有细胞毒作用的新颖的 marinonc 衍生物 neomarinone(6)、isomarinone(7)、hydroxydebromomarinone(8)和methoxydeuromomarinonc(9),它们均是倍半萜萘醌类抗生素。Neomarinone(6)和marinones(7~9)对HCrll6结肠癌细胞显示中等程度的体外细胞毒作用(IC50=8μg/ml),而且,neomarinone(6)对NCI-s60癌细胞也具有中等程度细胞毒作用(IC50=10μg/ml)〔6〕。 化合物花侧柏烯倍半萜(10~12)从希腊北爱情海希俄斯岛采集的红藻 L microcladia中分离得到〔7〕。红藻 L microcladia 经有机溶剂CH2Cl2/MeOH (3:1)提取,以Cyclohexane/EtOAc(9:1)为洗脱液进行硅胶柱层析,最后经HPLC纯化得到化合物(10-12)。该试验并对化合物活性进行了研究,发现三种化合物均对肺癌细胞NSCLC-N6 和 A-549有抑制作用,化合物(10):IC50=9 μM (NSCLC-N6)和8 μM (A-549),化合物(11):IC50 = 4μM (NSCLC-N6) 和4 μM (A-549) ,化合物(12):IC50= 7 μM (NSCLC-N6)和0 μM (A-549)。后两个化合物对肺癌细胞毒活性作用明显高于第一个化合物,推测可能由于后两个化合物结构中酚羟基以及五环内双键的存在提高了化合物活性,而化合物中溴原子的存在并没有对其活性构成影响。从中国南京采集的红藻L okamurai也分离出四种衍生的花侧柏烯倍半萜化合物,分别是Laureperoxide (13), 10-bromoisoaplysin (14), isodebromolaurinterol (15)和10-hydroxyisolaurene (16)〔8〕。5种snyderane倍半萜(17~21)化合物从红藻L luzonensis中分离得到〔9〕。 从一个软海绵种属Halichondria sp中分离得到四种具有抗微生物活性的含氮桉烷倍半萜化合物halichonadins A-D(22~25)〔10〕。该海绵采集于日本冲绳运天港,5 kg样品溶于4L MeOH,所得的115g MeOH提取物分别用1200ml EtOAc和400MlH2O萃取,9g EtOAc萃取物经硅胶柱层析后,洗脱液为MeOH/CHCl3(95:5)和石油醚/乙醚(9:1),得到化合物halichonadins A-D(22~25)和已知化合物acanthenes B、C。活性检测实验显示:化合物halichonadins A-D均具有抗细菌活性,同时halichonadins B和C也具有抗真菌活性,化合物halichonadins C对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的半致死浓度(IC50)达到0625μg/ml。三个部分环化的倍半萜(26~28)化合物具有抑制磷酸酶Cdc25B活性,从海绵Thorectandra 中分离得到〔11〕。冷冻的海绵样品经4℃去离子水浸泡冷冻干燥后得到的干涸物, 随后用MeOH/CH2Cl2(1:1)和MeOH/H2O(9:1)的有机溶剂提取获得粗提物。采用活性追踪的方式,对粗提物(IC50=8μg/ml)进一步分离,将其溶于100mlMeOH/H2O(9:1)有机溶剂中,得到2g的粗提物加入300ml正己烷,获得水相部分溶于MeOH/H2O(7:3)的溶剂中,再用300ml CH2Cl2提取得到的部分经活性测定显示对磷酸酯酶抑制活性最强(IC50=6μg/ml),之后采用反相C-18柱HPLC分离,得到部分环化的倍半萜化合物(26)16-oxo-luffariellolide(12mg, tR=18min),化合物(27) 16-hydroxy-luffariellolide (5 mg, tR=19min)以及化合物(28) luffariellolide (20mg, tR=38min)。五种属于倍半萜类的化合物hyrtiosins A-E (29~33),从中国海南两个不同地方的海绵Hyrtios erecta种属中分离得到〔12〕。 氧化的倍半萜化合物gibberodione(34), peroxygibberol(35) 和 sinugibberodiol(36)从台湾软珊瑚Sinularia gibberosa分离得到〔13〕,化合物(35)具有较温和的细胞毒性〔14〕。从珊瑚Eunicea 中提取的七种倍半萜代谢产物(37~43)〔15〕,含有榄烷,桉烷和吉玛烷骨架结构,研究显示对Eunicea 种属的疟原虫具有轻度的抑制作用。 3 二萜 以前很少有从绿藻中分离得到萜类化合物的报道,但是与2004年相比,提取的代谢产物数量有所增加〔16〕。从澳大利亚塔斯马尼亚采集的绿藻Caulerpa brownii中分离出许多新型二萜类化合物,其中化合物(44~48)在没有分支的绿藻中提取得到〔17〕,而类酯萜化合物(49)是从分支的绿藻中获得,该研究同时显示提取的类酯萜化合物对细胞、鱼类、微生物均有不同程度的毒性作用〔18〕。 日本Koyama K等人从褐藻Ishige okamurae来源的未知海洋真菌(MPUC 046)中分离到一种新型的二萜类化合物phomactin H(50)〔19〕。真菌(MPUC 046)经含150g小麦的400ml海水25℃发酵培养31天后,采用CHCl3溶剂提取、硅胶层析及HPLC纯化得到phomactin H。该化合物同已发现的phomactin A-G化合物一样,均属于血小板活化因子(PAF)拮抗剂,能抑制PAF诱导的血小板凝聚,同时推测此活性与化合物的某个特定骨架结构有关。 从法国南部大西洋海滨采集的褐藻Bifurcaria bifurcata中分离得到(51~55)五种新型的极性非环状二萜类化合物〔20〕。该褐藻经CHCl3/MeOH(1:1)提取,硅胶层析(洗脱液为不同比例的Hexane,EtOAc,MeOH),经反相C-18柱HPLC纯化获得十二种化合物,其中五种为新型二萜类化合物。化合物(51~53)在Hexane: EtOAc(2:3)洗脱液中发现,而化合物(54)和(55)则从Hexane: EtOAc(1:4)洗脱液中获得。 6种新型的Dactylomelane二萜类化合物 (56~61)从西班牙特纳里夫南部家那利群岛采集的红藻Laurencia中分离得到〔21〕,其结构具有C-6到C-11环化的单环碳新型结构。采集的红藻经CH2Cl2/MeOH(1:1)有机溶剂提取后,用洗脱液Hexane/CHCl3/MeOH(2:1:1)进行Sephadex LH-20反相色谱分离,结合TLC点样筛选的部分用洗脱液EtOAc/hexane(1:4)进行硅胶柱层析,最后采用硅胶柱进行HPLC纯化得到六种新型的单环碳二萜类化合物Dactylomelans。从红藻L luzonensis中也分离得到二萜类化合物luzodiol (62)〔9〕。一个溴代二萜类化合物 (63)从日本其他红藻Laurencia物种中分离得到 〔22〕。 Xenicane二萜类化合物(64~71)从台湾珊瑚Xenia blumi分离出来,而化合物xeniolactones A-C (72~74)则是从台湾Xenia florida中分离出来的〔23〕。化合物 (64~67), (69), (70) 和 (72)具有轻微的细胞毒性作用。非Xenicane代谢产物xenibellal (75)对Xenia umbellata也具有轻微的细胞毒性作用〔24〕。化合物Confertdiate (76)是一个四环的二萜类物质,从中国珊瑚Sinularia conferta中分离得到〔25〕。 从史密森尼博物院癌症研究所收集的海葵中分离得到的二萜类化合物actiniarins A-C (77~79)能适度抑制人cdc25B磷酸酶重组〔26〕。 Periconicins A,B (80~81)〔27〕是从内生红树林真菌Periconia 分离得到的二萜类的新化合物,能抑制不同微生物的生长活性,诸如bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6358p, Staphylococcus epidermis ATCC 12228等等。 南海真菌2492#是从采自香港红树林植物Phiagmites austrah样品中分离得到的,从2492#菌株的发酵液中分离得到的两种二萜类化合物 (82~83)有很好的生理活性〔28〕,如抗肿瘤、降压、调整心率失常,同时降压调整心率失常的作用在相同的条件下优于临床现用的阳性对照物。 从中国红树林植物Bruguiera gymnorrhiza分离出二萜类化合物 (84~86),化合物(86)对小鼠成纤维细胞具有适当的细胞毒活性〔29〕。也从中国红树林另一物种Bruguiera sexangula rhynchopetala分离出三种二萜类化合物 (87~89) 〔30〕。与之结构相似的二萜类化合物 (90~93)从中国Bruguiera gymnorrhiza中分离得到,其中化合物 (92)和 (93)有轻微的细胞毒活性〔31〕。 4 二倍半萜 Willam Fenical研究小组从曲霉属Aspergillus海洋真菌(菌株编号CNM-713)分离到一个新的二倍半萜化合物aspergilloxide (94),该化合物为含有25个碳原子的新骨架,对人的结肠癌细胞HCT-116有微弱的细胞毒活性〔32〕。在此之前,Willam Fenical等人从巴哈马的红树林中的漂浮木中也分离到一株真菌Fusarium heterosporum CNC-477, 并从中分离得到一系列多羟基二倍半萜类化合物neomangicols A-C(95~97)〔33〕和mangicols A-G (98~104)〔6〕,它们的结构如下图所示。Neomangicols的骨架为25个碳的二倍半萜,是首次从天然物中分离得到。药理实验显示化合物 (96)具有和庆大霉素大致相当的对革兰阳性细菌的抑制能力,化合物 (98)和 (99)对MPA(phorbol myristate acetate)诱导的鼠类耳朵水肿有抗炎症活性。5 三萜 从海洋生物中提取得到的三萜类化合物主要以三萜皂苷、三萜烯类、三萜糖苷等形式存在。四环三萜皂苷类化合物nobilisidenol (105) 和 (106)是从中国黑乳海参Holothuria nobilis分离得到的〔34〕。采集于福建东山的黑乳海参洗净切碎后用85%的EtOH冷浸提取,得到的流浸膏均匀分散于水中,依次用石油醚、二氯甲烷、n-BuOH萃取,研究发现n-BuOH提取物经大孔吸附树脂、正相硅胶层析、反相C-18硅胶柱层析以及反相C-18 柱HPLC分离得到三萜皂苷类化合物nobilisidenol (105)和(106)。易杨华等同时从海参中提取到了其它的三萜糖苷类化合物以及三萜皂苷脱硫衍生物〔35,36〕。三萜烯类化合物intercedensides D-I(107-112)从中国海参Mensamaria intercedens中分离得到,具有细胞毒功能〔37〕。新西兰海参Australostichopus mollis是单硫酸酯三萜糖甙化合物mollisosides A(113), B1(114) 和 B2(115)的来源〔38〕。 具有细胞溶解作用的三萜类化合物sodwanone S (116)是从印度洋多毛岛采集的海绵Axinella weltneri中分离得到的〔39〕。三萜苷类化合物sarasinosides J-M (117-120)分离自印尼苏拉威西岛采集的海绵Melophlus sarassinorum,对B subtilis和S cerevisae的细菌具有抗微生物活性作用〔40〕。 2 糖苷类化合物 从中国海南采集的甲藻A carterae中分离得到一种不饱和的糖基甘油酯化合物(121)〔41〕。甲藻采集于中国海南三亚,经分离筛选得到的A carterae大规模培养后用甲苯/MeOH(1:3)的有机溶剂提取,所得干涸物分别用甲苯、1N NaCl 水溶液提取。研究发现有机相提取物经硅胶柱(洗脱液为不同比例的MeOH/CHCl3)、反相C-18硅胶柱层析(洗脱液为MeOH/H2O=9:1),最后经反相C-18柱制备型HPLC(流动相为MeOH/H2O =95:5)分离纯化得到25mg不饱和的糖基甘油酯化合物(121)。从多米尼克普次矛斯采集的绿藻Avrainvillea nigricans中可以分离出一个甘油酯avrainvilloside(122),该化合物含有6-脱氧-6-氨基糖苷部分〔42〕。 两个甘油一酯化合物homaxinolin(123)和(124),磷脂酰胆碱homaxinolin(125)以及能抑制细胞生长的脂肪酸(126)是从韩国海绵Homaxinella 中分离得到的〔43〕。从红海采集的海绵Erylus lendenfeldi分离得到的两个甾体糖苷类化合物erylosides K(127)和L(128)能选择性的抑制酵母菌株的rad50芽体,rad50能修复协调受损的双链DNA〔44〕。 海参Stichopus japonicus是五种糖苷化合物SJC-1(129),SJC-2(130), SJC-3(131), SJC-4(132) 和 SJC-5(133)的主要来源〔45〕。五种化合物均从弱极性CHCl3/MeOH部分分离出来,其中SJC-1(129), SJC-2(130), SJC-3(131)是典型的鞘甘醇或植物型鞘甘醇葡萄糖脑苷脂类化合物,含有羟基化或非羟基化的脂肪酰基结构。SJC-4(132) 和 SJC-5(133)也含有羟基化的脂肪酰基结构,但是含有独特的鞘甘醇基团,是两种新型的葡萄糖脑苷脂类化合物。Linckiacerebroside A(134)是从日本海星Linckia laevigata分离出的一种新型糖苷脂化合物〔46〕。 甾体糖苷孕甾-5, 20-二烯-3β-醇-3-O-α-L-吡喃岩藻糖苷(135) 和 孕甾-5, 20-二烯-3β-醇-3-O-β-D-吡喃木糖苷(136)从中国短足软珊瑚Cladiella 中分离得到〔47〕。将新鲜的软珊瑚干质量 6 kg用乙醇在室温下浸泡 3 次, 合并提取液, 减压浓缩后得到深褐色浸膏 5g用30%的甲醇溶解后, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取, 石油醚提取液经减压浓缩后得棕黑色胶状物 5g,将此提取物硅胶柱减压层析, 用石油醚乙酸乙酯溶剂体系梯度洗脱, 从石油醚/乙酸乙酯(20:80)洗脱液中所得的洗脱部分在反相C-18柱上进行HPLC分离, 用MeOH洗脱得到化合物60mg(135)和3mg(136),该类化合物具有抗早孕和抑制肿瘤细胞生长活性。 四种甾体糖苷化合物(137-140)是从中国珊瑚Junceella juncea EtOH/CH2Cl2提取液中分离得到〔48〕。 3 结语 目前,从海洋生物中发现的萜类和糖苷类天然化合物的数量近几年呈现逐渐增加的趋势,有些化合物的活性确切而且活性作用强烈是很有希望的一些药物先导化合物,但是用于临床研究的化合物还相对较少,因此开发更多新的天然化合物是有必要的。其次,从海洋生物中发现的活性化合物也存在着活性较低或毒性较大等问题,可以通过对其结构进行修饰,使其活性达到最佳效果。此外,从海洋生物中提取的活性化合物含量通常较低,而且化合物在提取过程中受到提取试剂、方法等外界因素的影响,所以采用化学合成的方法进行化合物的半合成或者全合成解决化合物在提取过程中结构易变、试剂耗量大等缺点。例如从海洋真菌中发现的结构新颖,有抗菌、抗癌和神经心血管活性的物质头孢菌素C,就是从海洋真菌中分离得到的,这是一大类半合成的广为人知的抗生素,它已广泛用于临床〔49〕。所以采用合成或半合成的方法解决活性化合物作为药源的大量生产方式是通行的。我们期待着这些药物先导化合物在药物开发方面发挥重要作用。

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